第一卷

    第1章 概述

    第2章 表观遗传现象与机制

    第3章 表观遗传异常与人类疾病

    第4章 表观遗传学研究策略与技术

    第二卷

    第5章 细胞因子的种类、特性和功能

    第6章 细胞因子与肺部疾病

    第7章 细胞因子与心血管疾病

    第三卷

    第8章 自由基概述

    第9章 自由基与疾病

    第10章 防治自由基相关疾病的措施

    第四卷

    第11章 肿瘤病因学

    第12章 肿瘤发病学

    第13章 肿瘤侵袭与转移第14章 肿瘤诊断与防治的病理生理学基础

    第五卷

    第15章 代谢综合征的病因和机制

    第16章 代谢综合征时机体功能与代谢变化

    第17章 代谢综合征防治的病理生理学基础

    第六卷

    第18章 心功能不全的病因、诱因和分类

    第19章 心功能不全时机体的代偿适应反应

    第20章 心力衰竭的发生机制

    第21章 心功能不全时临床表现的病理生理基础

    第22章 心功能不全防治的病理生理基础

    第七卷

    第23章 概述

    第24章 肝性脑病

    第25章 肝肾综合征

    第八卷

    第26章 概述第27章 急性肾衰竭

    第28章 慢性肾衰竭

    第29章 尿毒症

    第九卷

    第30章 概述

    第31章 激素的概念、分类和作用机制

    第32章 内分泌调节系统

    第33章 内分泌疾病第1章 概述

    从DNA双螺旋结构的发现到描述遗传信息流向的“中心法则”，很长

    时间以来人们一直认为基因决定着生命过程中所需要的各种蛋白质，决

    定着生命体的表型。近年来，科学家们发现了一些与“中心法则”相悖的

    遗传现象，例如同窝出生纯种小鼠的毛色不同；基因组完全相同的同卵

    双胞胎在性格、健康和对疾病的易感性上存在差异等。这类变异可以在

    DNA序列不变的情况下，使基因功能发生可遗传的变化，并最终导致表

    型的改变，故被称为“表观遗传变异(epigenetic variation)”。

    表观遗传学(epigenetics)是研究表观遗传变异的遗传学分支学

    科。Epigenetics这一术语最早由生物学家C.h.Waddington在1942年定义

    为“研究基因与决定表型的基因产物之间的因果关系”，该定义在当时主

    要被应用于生物发育过程的研究。1975年，R.holliday对表观遗传学进行

    了更为准确的描述，即“表观遗传学研究没有DNA序列变化的、可遗传

    的基因表达改变”。1996年，A.D.Riggs将表观遗传学进一步定义为“研究

    在有丝分裂及减数分裂过程中无法用DNA序列改变来解释的基因功能的

    可遗传性改变”。该定义有三个密切相关的含义：(1)是可遗传的，即

    这类改变通过有丝分裂或减数分裂能在细胞或个体世代间遗传；(2)

    可逆性的基因表达调节；(3)没有DNA序列的变化或不能用DNA序列

    变化来解释。广义上，DNA甲基化、组蛋白修饰、基因沉默、基因组印

    迹、染色质重塑、RNA剪接、RNA编辑、RNA干扰(RNA

    interference，RNAi)、X染色体失活(X-chromosome inactivation)和蛋

    白质剪接等均可归为“表观遗传”范畴。近年来，表观遗传学已成为许多

    生命学科的研究前沿，更是当今遗传学和基因研究的一个热点，具有重

    要的理论和实际意义。

    经典遗传和表观遗传是一个事物(遗传)的两个方面，既相互区别

    又相互依存而构成一个整体。由此可认为基因组含有两类信息：遗传编

    码信息提供合成蛋白质的模板；而表观遗传信息则提供了何时、何地及

    以何种方式应用遗传信息的指令。基因组通过DNA精确地复制、转录和

    翻译，保证了遗传信息的稳定性和连续性。同时又通过表观遗传学机

    制，使基因组对各种内外环境条件作出反应，选择性地表达信息，最终

    形成遗传性状。可以说表观遗传学使复杂的生命体在具有稳定性的基础

    上，又具备了精确的反应性和强大的适应性。

    生物系统正常功能的维持正是依赖于不同基因在多样的表观遗传修

    饰调控下开启或关闭。基因本身发生变异或调控模式发生异常，均可导

    致疾病的产生。与单基因疾病不同，在动脉粥样硬化、肿瘤、精神分裂症、糖尿病等常见多基因复杂性疾病的发病过程中，遗传因素并不起决

    定性作用，通常需要环境、营养等外界因素作用后才会发病。而这些外

    界因素正是通过对疾病相关遗传信息的表达进行表观调控来完成的。如

    肿瘤细胞往往存在整体基因组甲基化水平低、一些抑癌基因又被异常甲

    基化而沉默的现象；染色质修饰酶因为染色体转位形成融合蛋白而与一

    些人类白血病相关等。因此，从遗传学和表观遗传学两个方面进行研究

    有助于全面了解疾病的分子机制，对寻找更为有效的疾病诊断、预防方

    法及发现新的靶向性治疗药物都有重要意义。第2章 表观遗传现象与机制

    在过去的50年间，随着人们对真核基因表达调控分子机制研究的深

    入，表观遗传学的含义和研究内容也在不断更新。许多与经典孟德尔定

    律不相符的遗传方式和案例被重新认识和理解。目前发现的常见表观遗

    传现象包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、基因印迹、X染色

    体失活、RNA调控(RNA干扰等)、转座元件、副突变、位置斑效

    应、等位反式互补等。其中，DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA

    更是主要的表观遗传调控机制。本节将对主要的表观遗传现象和机制作

    一简单介绍。

    一、DNA甲基化

    甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，通常是指在

    DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，将甲基

    添加在DNA分子中的碱基上。作为调节基因组功能的重要手段，DNA

    甲基化(DNA methylation)在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育

    以及人类肿瘤发生中都起着重要作用。常见的DNA甲基化发生在DNA

    链上的胞嘧啶第5位碳原子上。胞嘧啶突出于DNA双螺旋并进入与DNA

    甲基转移酶DNMT结合部位的裂隙中。DNMT将S-腺苷甲硫氨酸(S-

    adenosylmethionine，SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5’位，形成5甲基胞

    嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。在脊椎动物中，CpG二核苷酸是DNA

    甲基化发生的主要位点。基因组中大约有60%~90%的CpG序列被甲基

    化。而大多数非甲基化的CpG常以成簇串联的形式存在于基因的5’端调

    控区段，这种富含CpG的一段DNA区域称为CpG岛(CpG island)，通

    常长度在1～2kb。DNA甲基化的研究与CpG岛的研究密不可分。CpG岛

    主要位于基因的启动子区，少量位于外显子区，一般呈非甲基化状态。

    启动子区的CpG甲基化可直接导致基因沉默，其机制可能与在空间上阻

    碍转录因子复合物与DNA的结合相关。因此，DNA甲基化一般与基因

    沉默(gene silence)相关联；而非甲基化一般与基因的活化(gene

    activation)相关联；而基因下游即非岛区CpG的甲基化则通常不抑制基

    因的转录。

    DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家族DNMT来催化的。

    DNMT分两种:一种是维持性甲基化酶，主要指DNMTl；另一种是重新

    甲基化酶如DNMT3A和DNMT3B。维持性甲基化(maintenance

    methylation)是指在甲基化的DNA模板指导下使新合成的链甲基化。当

    甲基化的DNA序列被复制时，新合成的DNA双链呈半甲基化

    (hemimethylated)，即只有母链有完整的甲基化标记，这时另一条链会经DNMT的催化而在与母链上5mC对称的位置上使相应的胞嘧啶甲基

    化。这对于基因印迹中DNA甲基化模式的维持非常关键，是重要的表观

    遗传机制。重新甲基化(de novo methylation)是指无需模板指导从头

    合成的甲基化修饰。如在哺乳动物胚胎形成的初期，基因组中DNA会发

    生去甲基化，随后，会在重新甲基化作用下恢复到正常的甲基化水平。

    在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞，从而建立

    起一种细胞记忆的形式。但在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚

    胎期，其基因组范围内的甲基化模式会通过大规模的去甲基化和接下来

    的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞。

    DNA甲基化直接影响到基因的活化状态，在生命过程中扮演着非常

    重要的角色。一方面，DNA甲基化在高等生物的生长发育中有重要作

    用。在胚胎发育和分化的过程中，尽管DNA序列通常没有改变，但在特

    异性组织和器官中基因的表达因为DNA甲基化状态等因素的影响而具有

    特定的模式。相同类型细胞间存在高度保守的甲基化模式，而同一器官

    的不同类型的细胞中甲基化模式是不同的。甲基化模式最早建立于配子

    形成期，并在发育过程中不断变化，通过甲基化、去甲基化等机制维持

    甲基化模式的动态平衡。另一方面，DNA甲基化被发现与很多疾病，尤

    其是肿瘤的发生发展关系密切。肿瘤细胞通常呈现“基因组整体甲基化

    水平降低”和“一些抑癌基因被错误地高甲基化而异常沉默”的现象。

    此外，DNA甲基化和其他生命过程也有重要的联系，如雌性哺乳动

    物的X染色体失活，使体内X染色体上基因表达剂量维持平衡；管家基

    因的低甲基化，使其具有持续的表达活性；印迹基因的高甲基化，使其

    具有不同于经典孟德尔式的遗传方式；作为机体天然防御体系的转座

    子、病毒基因组的甲基化等。

    值得注意的是，虽然DNA甲基化与基因沉默密切相关，但是一些研

    究表明DNA甲基化可能并不是基因沉默的原因，而可能是结果。同时，虽然DNA甲基化模式可以在细胞间传递，但它不是永久的。实际上，个

    体的一生都在经历着DNA甲基化模式的改变。一些变化可能是基于对环

    境改变的适应，而另一些变化可能与恶性转化或细胞老化等病理进程有

    关。目前对导致DNA甲基化改变的内外因素仍不十分清楚。对人类疾病

    DNA甲基化的深入研究将有助于我们理解表观遗传对人类生命的影响。

    二、组蛋白修饰

    组蛋白是染色质基本结构核小体的重要组成部分。组蛋白h2A、h2B、h3和h4分别形成同源二聚体，共同组成八聚体组蛋白，约200bp的

    DNA分子盘绕在八聚体外形成一个核小体。相邻核小体之间的DNA上

    结合组蛋白h1。通过组蛋白氨基末端的翻译后修饰实现对染色体结构和基因转录的精密调控是目前表观遗传学研究领域的重要内容。游离在外

    的组蛋白氨基末端可发生多种共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化、糖基化等。这些修饰方式与基因的活化或抑制相

    关，并共同构成了“组蛋白密码(histone code)”的假说，即在一个或多

    个组蛋白氨基末端的多种修饰状态，可以互相联合或依次地被特定的蛋

    白或其他复合体等识别、结合而起作用，为发动或阻遏基因转录的染色

    质相关蛋白提供结合位点。组蛋白氨基端修饰调控异常可通过影响基因

    表达而与多种疾病关系密切。

    组蛋白的乙酰化一般与活化的染色质构型——常染色质和有表达活

    性的基因相联系。通常组蛋白在转录活性区域乙酰化，使与其结合的基

    因处于转录活化状态，而低乙酰化的组蛋白位于非转录活性的常染色质

    区域或异染色质区域。

    乙酰化多发生在核心组蛋白N端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸K

    残基。由于K为正电荷氨基酸，可帮助组蛋白与DNA的负电荷糖-磷酸

    骨架紧密结合，乙酰化造成的正电荷中和效应可减弱DNA与组蛋白的相

    互作用，使染色质呈疏松状态而有利于基因的表达。组蛋白的乙酰化状

    态由组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase，hAT)和组蛋白去

    乙酰化酶(histone deacetylase，hDAC)共同作用决定。前者将乙酰辅

    酶A的乙酰基转移至组蛋白氨基末端中特定的赖氨酸残基上，后者的功

    能则相反。hAT家族可作为辅激活因子调控转录，调节细胞周期，参与

    DNA损伤修复，还可作为DNA结合蛋白。hDAC家族则与染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周期、细胞分化和增殖以及细胞凋亡相关。

    已知乙酰化修饰可发生在组蛋白h3的K9、K14、Ly18、K23和h4的K5、K8、K12、K16等位点，不同位置的修饰均需特定的酶来完成。

    2.组蛋白的甲基化

    组蛋白的甲基化修饰比较复杂，可发生在精氨酸R的胍基或是赖氨

    酸K的ε氨基上。每个K可以有3种不同的甲基化状态，即单甲基化、双

    甲基化和三甲基化，而R也可以被单甲基化或者双甲基化(双甲基化又

    可分为对称型和非对称型)。目前共发现h3和h4的N端有超过5个K位点

    (h3K4、h3K9、h3K27、h3K36和h4K20等)和5个R位点(h3R2、h3R8、h3R17、h3R26和h4R3等)可被甲基化，h3的核心还有K79也能

    被甲基化。如果把这些甲基化信息都考虑在内，则可产生大于3×1011种

    不同的组合状态，这为组蛋白发挥多样化的调控作用大大提供了可能。

    组蛋白的甲基化与许多重要的生物学过程密切相关，包括异染色质

    形成、基因印记、X染色体失活、基因转录调控、DNA损伤反应等。研

    究表明，和乙酰化往往与基因活化相关不同，组蛋白甲基化对基因表达调控的作用比较复杂，如R的甲基化及h3K4、h3K36、h3K79的甲基化

    通常与基因活化有关，而h3K9、h3K27和h4K20的甲基化则经常与基因

    表达抑制相关。组蛋白甲基化是由组蛋白甲基转移酶(histone

    methyltransferase，hMT)催化的，根据识别的氨基酸不同又分为组蛋白

    赖氨酸甲基转移酶(hKMT)和组蛋白精氨酸甲基转移酶(hRMT)。

    而组蛋白的去甲基酶在很长一段时间内一直未被发现，加之细胞总体的

    甲基化水平改变不明显，组蛋白甲基化曾一度被认为是一种不可逆的稳

    定表观遗传标志。直到2004年Shi等人发现了第一个组蛋白去甲基酶

    LSD1(1ysine specific demethylase 1)，这种观念才被彻底打破。其

    后，一大批含JmjC域的组蛋白去甲基酶家族成员被陆续发现，功能涉及

    神经系统疾病、内分泌调节及肿瘤的生成等。目前认为，不同位点、甚

    至不同程度的甲基化状态均由特异性甲基转移酶或去甲基酶来识别。如

    此精细的调控机制说明组蛋白的甲基化修饰可能在细胞整个生命活动过

    程中扮演着重要的角色。

    3.组蛋白的磷酸化

    组蛋白的磷酸化修饰在基因转录、有丝分裂、细胞凋亡、DNA损伤

    修复、DNA 复制和重组过程中发挥着直接的作用。通常认为磷酸基团

    携带的负电荷中和了组蛋白上的正电荷，造成组蛋白和DNA之间亲和力

    的下降。研究显示组蛋白h3的第10位丝氨酸(S10)的磷酸化对基因转

    录的起始和有丝分裂期染色体凝集时形态结构的改变都有重要作用。在

    哺乳动物中，aurora B是有丝分裂时h3S10磷酸化的激酶。此外，S10的

    磷酸化可增强几种乙酰转移酶的催化活性，从而提高基因的转录活性。

    组蛋白h2A的变体h2AX可在DNA双链断裂损伤(DNA double strand

    breaks，DSBs)发生后迅速被ATM和ATR蛋白激酶在第139位丝氨酸

    (S139)磷酸化，形成γ-h2AX。研究发现大量组蛋白h2AX在DNA双链

    断裂位点发生磷酸化并形成荧光下可以分辨的焦点(foci)。一旦DNA

    损伤消除(如被修复)，该结合位点就消失。并且，γ-h2AX所形成的

    焦点与发生DSBs数量存在一一对应关系，因此，γ-h2AX有望成为DSBs

    的早期效应生物标志物。除标志性作用外，γ-h2AX的形成对于DNA损

    伤的高效修复是必需的，说明该过程可能介导了染色体结构的变化及起

    到募集或参与修复复合体的作用。

    组蛋白h1被细胞周期蛋白依赖的激酶磷酸化是其主要的翻译后修

    饰。组蛋白h1的磷酸化能影响DNA二级结构和染色体凝集状态的改变。

    同时，组蛋白h1的磷酸化需要DNA的复制，并能被激活DNA复制的蛋

    白激酶所促进。

    4.组蛋白的泛素化蛋白质的泛素化修饰就是蛋白质的赖氨酸残基位点与泛素分子的羧

    基端相互结合的过程。组蛋白h2A的泛素化主要发生在高度保守的K119

    位点。哺乳动物h2BK120位的泛素化和h3K4和K79位的甲基化往往标志

    着活性染色质区域。组蛋白的泛素化过程也是可逆的，经诱导后会被去

    泛素化。

    三、染色质重塑

    染色质高度紧密的折叠阻止了转录因子和辅因子与DNA的结合。在

    DNA复制、转录、修复和重组等过程中，染色质的包装状态、核小体中

    的组蛋白及对应的DNA分子会发生改变，这些结构变化被称为染色质重

    塑(chromatin remodeling)。其基本生物化学特点是染色质的一定区域

    对核酸酶敏感性的改变，对应的物理改变是核小体的位置和状态的变

    化。

    目前认为，染色质重塑至少是通过两种机制来完成的，一种是通过

    ATp依赖的染色质重塑复合物(ATp-dependent chromatin remodeling

    complex)，另一种是通过对组蛋白尾部进行共价修饰的组蛋白修饰酶

    复合物(histone modifying complex)。前者是利用水解ATp获得的能量

    改变组蛋白与DNA之间的相互作用；后者对组蛋白的尾部进行共价修

    饰，包括赖氨酸的乙酰化、赖氨酸和精氨酸的甲基化、丝氨酸和苏氨酸

    的磷酸化、赖氨酸的泛素化和谷氨酸的多聚ADp核糖基化等。通过组蛋

    白修饰酶的作用，既可破坏核小体之间以及组蛋白尾部与基因组DNA之

    间的相互作用，引起染色质的重塑，又可作为染色质特异位点的标志，为高级染色质结构的组织者及与基因表达相关的蛋白提供识别位点。关

    于组蛋白修饰的内容详见上一节，这里仅简单介绍染色质重塑复合物的

    种类及作用机制。

    染色质重塑复合物都含有ATpase亚基，此亚基属于SNF2蛋白超家

    族。根据亚基的同源性，可分为SWISNF、ISWI、ChD、INO80SWR1、Rad54等亚家族。一般认为，重塑复合物均可结合核小

    体，且在结合后其ATp酶活性会上升。其中ISWI复合物与核小体的结合

    力较强，可能通过与组蛋白的相互作用而导致核小体移动并激活染色

    质；而SWI-SNF复合物则与裸DNA结合力较强，可能通过改变与核小体

    结合的DNA构型产生活性染色质。

    目前认为染色质重塑主要存在滑动、重建和组蛋白突变体交换模

    型。滑动模型是指染色质重塑复合物以ATp水解释放的能量对核小体进

    行重塑，结果组蛋白多聚体滑行到同一个DNA分子的另一位点，称为顺

    式滑行；或滑行到不同DNA分子的某一位点，称为反式滑行。滑行的结

    果使组蛋白八聚体与DNA发生相对移动，核小体DNA的限制性酶切位点暴露，并促使转录因子与相应序列元件结合。重建模型是指核小体的

    重建。可以是两个独立的核小体被结合在一起形成一个新的稳定结构。

    而组蛋白突变体交换模型的建立则是基于SWR1复合物的发现。该复合

    物可水解ATp，使h2AhAB与h2A.Zh2B二聚体发生交换。

    四、基因印记

    基因印记(gene imprinting)是指来自父方和母方的等位基因在通

    过精子和卵子传递给子代时发生了某种修饰，这种作用使其后代仅表达

    父源或母源等位基因的一种，也称为基因组印记(genomic

    imprinting)。目前发现的印记基因大约80%成簇，这些成簇的基因被位

    于同一条链上的顺式作用位点所调控，该位点被称作印记中心

    (imprinting center，IC)。

    基因印记的具体机制目前还不是非常清楚，但通常认为与DNA甲基

    化造成的亲代基因特异性关闭相关。在器官的发育过程中，这些印记在

    某些体细胞中能保留下来，在另外一些中则被去除。目前在小鼠和人类

    中已经各发现超过80个印记基因，但基因表达谱的分析结果表明其数量

    可能更多。印记基因的存在可能体现了两性间的竞争，从已发现的印记

    基因看，父方对胚胎的贡献是加速其发育；而母方的贡献则是限制胚胎

    的过度发育生长从而提高生育后代的数量。此外，也有研究表明，通过

    印记的方式可保护一些等位基因免受选择压力的影响，从而提高群体对

    环境变化的适应能力。印记还可防止哺乳动物中的孤雌生殖。

    五、X染色体失活

    在哺乳动物中，雌性个体细胞内有两条X染色体，而雄性只有一

    条，为了保持平衡，雌性的一条X染色体被永久失活，这便是“剂量补

    偿”效应。进一步的研究表明，雌性个体的X染色体失活遵循n-1法则，不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。这种现象就被

    称为X染色体失活或里昂化。失活的X染色体常浓缩成染色较深的染色

    质体，通常位于间期核膜边缘，称为“巴氏小体(Barr body)”或X小

    体。

    X染色体失活的选择和启动发生在囊胚期，这个过程由X失活中心

    (X-inactivation center，Xic)控制。Xic是一个顺式作用元件，包含辨

    别X染色体数目的信息和Xist基因，前者可保证仅有一条染色体有活

    性，但机制不明，后者缺失将导致X染色体失活失败。X染色体失活的

    过程为：Xist基因编码Xist RNA，转录后不断扩展、包裹合成它的X染

    色体，然后一些对基因沉默有重要功能的因子(如pcG蛋白等)被招

    募，诱导DNA甲基化和组蛋白修饰的发生。关于Xist基因，以前认为是X染色体失活的触发因素，但在对小鼠的研究表明，该基因的缺失并不

    影响X染色体失活的启动，可能对失活状态的维持更为关键。Xist的抑

    制还可被另一种未翻译的RNA(Tsix)所调节。Tsix基因通过编码Xist

    的互补序列可抑制Xist的积累。

    一般认为，母系遗传的X染色体(Xm)在卵子里呈活化状态，父

    系遗传的X染色体(Xp)在精子中是沉默的。受精后，在胚胎植入前，Xp被重新激活，之后Xm和Xp将随机失活。第3章 表观遗传异常与人类疾病

    表观遗传学是研究在不改变DNA序列的情况下基因表达发生改变的

    机制，以及这种改变在有丝分裂和减数分裂过程中如何遗传给子代的。

    在过去的几十年中人们发现很多表观遗传调节异常将影响染色质结构和

    基因表达，导致复杂的综合征、多因素疾病以及肿瘤等多种疾病。与

    DNA水平的变化不同的是，许多表观遗传改变被发现是可逆的，这就为

    疾病的治疗提供了更为乐观的前景。目前发现，受到表观遗传调节影响

    的疾病包括肿瘤、心血管疾病、代谢综合征及自身免疫性疾病等。

    在“后基因组”时代，理解表观遗传的运作机制对于人类疾病的防治具有

    重要且深远的意义。

    疾病表观遗传异常α-地中海贫血症和X染色质连锁的智力发育迟缓

    (ATRX综合征)ATRX突变引起DNA甲基化异常脆性X染色体综合征

    FMR1基因5’端非翻译区的CGG重复序列扩增和异常甲基化导致基因沉

    默ICF 综合征DNMT3B基因突变Angelman综合征15q11-13区基因印记异

    常(母源)prader-Willi综合征15q11-13区基因印记异常(父源)

    BWS11p15.5基因印记异常(涉及基因如IGF2)Rett综合征MeCp2基因突

    变各种肿瘤MLh1启动子重新甲基化引起基因沉默导致微卫星不稳定

    启动子重新甲基化引起基因沉默导致Rb、p53信号通路失调

    SNF5、BRG1、BRM基因突变导致SWISNF染色质重塑复合物失调

    印记缺失导致IGF2过表达、CDKN1C基因沉默白血病染色体转位

    (影响hAT等)Rubinstein Taybi综合征CBp基因突变Coffin-Lowry综合征

    Rsk-2基因突变

    一、DNA甲基化与人类疾病

    DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，将甲基

    基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在CpG双核苷酸

    序列。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，发生

    DNA甲基化可导致基因表达沉默。

    DNA甲基化被发现与很多疾病，尤其是肿瘤的发生发展关系密切。

    DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，主要呈现以下特

    点：(1)基因组整体甲基化水平降低和癌基因的不充分甲基化导致遗

    传不稳定性增加及癌基因重新活化或异常表达；(2)CpG岛局部甲基

    化程度的异常升高引起抑癌基因高甲基化而失活。目前肿瘤甲基化的研

    究主要集中在抑癌基因。已发现相关基因涉及细胞周期(pRB、p16、p15、p53等)、DNA损伤修复(O6-MGMT、BRCA1、hMLh1等)、信号传递(SOCS、TMS1D等)和激素应答等。

    DNMT活性异常也和多种疾病有密切关系，例如DNMT3B基因突变

    可导致常染色体隐性遗传病“着丝点不稳定和面部异

    常”(immunodeficiency centromeric instability and facial anomalies)，即

    ICF 综合征。主要表现为免疫缺陷和面部异常。高同型半胱氨酸血症

    (hypohomocysteine，hhcy)与DNMT1活性降低引起的DNA低甲基化有

    关，而hhcy是动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素。DNMT基因的过

    量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生相关。系统性红斑狼

    疮(SLE)等自身免疫性疾病患者的T细胞存在DNMT活性的异常改

    变。

    二、组蛋白修饰与人类疾病

    组蛋白的修饰状态不仅控制着转录复合物能否靠近，影响基因的表

    达活性，而且能有效调节染色质转录活跃或沉默状态的转换，并对其他

    蛋白因子和DNA的结合产生协同或拮抗效应。常见的组蛋白修饰包括乙

    酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等，是构成组蛋白密码的基本

    要素。其中，与人类疾病相关性研究较多的是乙酰化和甲基化。

    组蛋白乙酰化过程的异常，如hAT、hDAC及相关蛋白发生突变或

    活性改变，可引发包括遗传病、肿瘤等在内的多种疾病。如乙酰基转移

    酶CBp(CREB binding protein，CBp)的突变可导致Rubinstein Taybi综

    合征，患者智力低下、面部畸形、拇指和拇趾粗大、身材矮小；甲基化

    CpG-结合蛋白-2(methyl cytosine binding protein-2，MeCp2)可募集去

    乙酰化酶到甲基化的DNA区域，使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩，MeCp2基因的突变可导致Rett综合征，患者出生即发病，智力发育迟

    缓，伴孤独症；人类白血病细胞由于染色体转位形成融合蛋白，可异常

    募集hDAC，引起组蛋白过度去乙酰化，进而使基因转录受到抑制和白

    血病发生；hDAC在前列腺癌标本中表达明显上升；乳腺癌、卵巢癌和

    胃肠道恶性肿瘤中常存在组蛋白乙酰化和去乙酰化的异常。另外，如果

    抑制hDAC的活性、阻止组蛋白的过度低乙酰化，可引起抑癌基因表达

    水平增加，达到抑制肿瘤细胞增殖或诱导凋亡的目的。因此，hDAC抑

    制剂被认为是一类具有广泛应用前景的抗肿瘤药物。

    组蛋白的甲基化也被发现与人类疾病的发生密切相关。Suv39h12

    敲除小鼠发生染色体错误分离，可导致B细胞淋巴瘤。人的Suv39h12与

    视网膜胶质细胞瘤蛋白共同调节周期蛋白1的表达，该基因失活可导致

    增殖失控而发生癌症，如非霍奇金淋巴瘤。组蛋白甲基化的异常还与人

    类白血病发生、乳腺癌的侵袭和转移相关。S-腺苷同型半胱氨酸能选择

    性抑制组蛋白的甲基化，其水平的增加与细胞甲基化水平的降低已成为解释高同型半胱氨酸血症与心血管疾病及神经系统疾病之间关系的一个

    机制。组蛋白甲基化的改变对于肿瘤发生过程中DNA甲基化相关基因的

    沉默非常关键，如肿瘤中的基因沉默往往伴随着h3K4的低甲基化和

    h3K9的高甲基化。

    三、染色质重塑与人类疾病

    染色质重塑是DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物的共同

    作用。它通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点。其

    中染色质重塑因子复合物主要包括SWISNF复合物和ISW复合物。染色

    质重塑复合物如果发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常

    表达，导致人类疾病。如果突变引起抑癌基因出现异常，将导致肿瘤的

    发生。ATRX、ERCC6、SMARCAL1均编码与SWISNF复合物相关的

    ATp酶。ATRX突变引起DNA甲基化异常可导致一些遗传性疾病，如X

    连锁α-地中海贫血综合征、Juberg-Marsidi综合征、Carpenter-Waziri综合

    征、Sutherland-haan综合征和Smith-Fineman-Myers综合征。这些疾病与

    核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关。ERCC6的突变将导致

    Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal综合征和B型Cockayne综合征。前者表现为

    出生后发育异常、神经退行性变、进行性关节挛缩、夭折；后者表现出

    紫外线敏感、骨骼畸形、侏儒、神经退行性变等症状。这两种病对紫外

    诱导的DNA损伤缺乏修复能力，表明ERCC6蛋白在DNA修复中有重要

    的作用。SMARCAL1的突变可导致Schimke免疫性骨质发育异常，表现

    为多向性T细胞免疫缺陷，临床症状表明SMARCAL1蛋白可能调控和细

    胞增殖相关基因的表达。BRG1、SMARCB1和BRM编码SWISNF复合

    物特异的ATp酶，这些酶通过改变染色质的结构使视网膜母细胞瘤

    (Rb)蛋白维持正常功能，这些基因发生突变可导致肿瘤形成。

    四、基因组印记与人类疾病

    基因组印记是指二倍体细胞的一对等位基因(父本和母本)只有一

    个可以表达，另一个因表观遗传修饰而沉默。印记丢失导致等位基因同

    时表达或有活性的等位基因突变，均可引起人类疾病。一些环境因素，如食物中的叶酸也会破坏印记。印记丢失不仅影响胚胎发育，还可诱发

    出生后的发育异常。如印记基因IGF2h19、CDKN1C、LIT1等出现变异

    或印记丢失可导致BWS综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome)，患

    者表现为胚胎和胎盘过度增生、巨舌、巨大发育等。15号染色体的表观

    遗传异常可导致prader-Willi综合征(pWS)和Angelman综合征

    (AS)。pWS是由于突变导致父本表达的基因簇沉默，印记基因(如

    SNURFSNRpN)在大脑中高表达所致，患者表现为肥胖、身材矮小和

    轻度智力发育迟缓等；AS是由于母本表达的UBE3A或ATpIOC基因的缺失或受到抑制所致，该基因编码泛素蛋白连接酶并在脑中表达，患者表

    现为共济失调、过度活跃、严重智障、少语、表情愉悦等。印记基因的

    异常同样可诱发肿瘤，包括急性早幼粒细胞白血病、横纹肌肉瘤和散发

    的骨肉瘤等。

    与基因组印记相关的疾病常常是由于印记丢失导致两个等位基因同

    时表达，或突变导致有活性的等位基因失活所致。调控基因簇的印记中

    心发生突变将导致一系列基因不表达，引发复杂综合征。基因组印记的

    本质仍为DNA修饰和组蛋白修饰，所以和印记相关的蛋白发生突变也将

    导致表观遗传疾病。

    五、X染色体失活与人类疾病

    和X染色体失活相关的疾病多是由X染色体的不对称失活使携带有

    突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致。如WASp基因突

    变可引起Wiskott-Aldrich综合征，表现为免疫缺陷、湿疹、伴血小板缺

    乏症。因为女性为嵌合体，携带有50%的正常基因，通常无症状表现，所以该病患者多为男性。而女性患病时往往是由于不对称的X染色体失

    活，即携带有正常WASp基因的染色体过多失活。在女性体内还存在另

    一种机制，通过不对称失活使携带有突变基因的X染色体大部分失活。

    如pelizaeus-Merzbacher病患者中带有突变pLp基因的X染色体倾向于失

    活；Rett综合征中携带有MeCp2突变基因的X染色体更易失活。此外，X

    染色体失活异常导致抑癌基因功能的丧失与多种肿瘤的发生密切相关。

    六、非编码RNA与人类疾病

    功能性非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，在基

    因表达中发挥重要的作用。长链RNA可影响染色质结构的改变。短链

    RNA对外源的核酸序列有降解作用以保护自身的基因组。小干涉

    RNA(short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)都属于短链RNA，前者是RNA干扰的主要执行者，后者也参

    与RNA干扰但有自己独立的作用机制。

    由于miRNA在肿瘤细胞中的表达显著下调，p53基因可通过调控

    miRNA-34a-c的表达抑制肿瘤。此外，非编码RNA对预防疾病发生有重

    要的作用。染色体着丝粒附近有大量的转座子，转座子可在染色体内部

    转座导致基因失活而引发多种疾病甚至癌症。然而在着丝粒区存在大量

    有活性的短链RNA，它们通过抑制转座子的转座而保护基因组的稳定

    性。在细胞分裂时，短链RNA异常将导致染色体无法在着丝粒处开始形

    成异染色质，引起细胞分裂异常。如果干细胞发生这种情况可能导致癌

    症的发生。siRNA可在外来核酸的诱导下产生，进而通过RNA干扰机制清除外来的核酸，这对预防传染病有重要作用。疾病中RNA干扰的深入

    研究将为一些重大疾病的治疗带来新的希望。

    七、表观遗传学与心血管疾病

    动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、心绞痛等主要心

    血管疾病的病理始动因素。已发现AS细胞存在DNA异常甲基化的情

    况。该过程与高半胱氨酸和低叶酸水平相关。正常时，提供甲基化基团

    的叶酸会将半胱氨酸转化为甲硫氨酸，而甲硫氨酸会变成通用的甲基化

    供体——S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM负责甲基化DNA等生物底

    物。高半胱氨酸和低叶酸水平可造成SAM不足及DNA低甲基化，进而

    促使血管平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMCs)增殖及纤维沉积。

    外周血的低甲基化可使参加免疫和炎性反应的细胞过度增殖，从而加重

    AS时的炎性反应。所以高半胱氨酸水平、低叶酸及低维生素B水平均是

    引起主动脉及外周血淋巴细胞DNA低甲基化从而导致AS的危险诱发因

    素。AS过程还伴随DNA和组蛋白的高甲基化现象。实验表明，引起AS

    的巨噬细胞DNA和组蛋白h4均出现了高甲基化，说明基因沉默和异染色

    质生成可能是AS的早期特征和成因。人类雌激素受体α(estrogen

    receptor α，ERα)DNA高甲基化与AS、老年病和其他心血管疾病密切

    相关。正常的ERα除了发挥抑制细胞(包括SMCs)生长作用外，还会

    与循环中的雌激素起反应而产生具有保护作用的NO，使局部血管扩

    张。严重动脉硬化症患者动脉中ERα基因甲基化程度提高引起表达下

    调，直接导致抑制细胞生长的能力减弱，从而加重SMCs的增殖。而

    且，在小鼠和人类中，这些变化可以由导致动脉硬化的食谱触发。可见

    环境因素导致的AS表观遗传规律及进程可受饮食、衰老和遗传等因素

    的调控。

    另外，SMCs在适应环境变化的过程中体现了典型的表观可塑性。

    血清反应因子(serum response factor，SRF)及其辅助因子与SMC染色

    质启动子区的CArG box DNA序列相互反应，是引起SMC在生长发育或

    疾病过程中分化的信号通路关键环节。组蛋白修饰通过调控SRF及其辅

    助因子与染色质模板的结合，从而在胞外环境变化影响SMC分化的过程

    中发挥重要作用。这一过程包括：异染色质上的组蛋白甲基化可召集甲

    基化结合蛋白(methyl binding proteins，MBps)，促进染色质压缩和转

    录因子与DNA的结合；而在常染色质上，组蛋白乙酰化则抑制核小体压

    缩从而提供可结合的DNA。当外环境暂时抑制转录活动时，组蛋白去乙

    酰化酶hDAC移去乙酰基，引起染色质压缩，并抑制转录因子结合。此

    外，心肌细胞中关键组蛋白的乙酰化还可导致心肌肥大和心力衰竭。

    八、表观遗传学与代谢综合征代谢综合征(metabolic syndrom，MS)是以胰岛素抵抗为基础的一

    组复杂的代谢紊乱症候群，包括糖耐量减低、2型糖尿病、肥胖、脂质

    代谢紊乱及高血压等。目前认为这些疾病的根源可能在于个体的早期营

    养状况(妊娠和哺乳期间)，而表观遗传程序在相关发病过程中具有重

    要作用。表观遗传机制对于环境或营养的改变呈现较高的易感性：如妊

    娠期间限制蛋白质会增加在小鼠后代中胰腺细胞凋亡的速率，导致胰腺

    B细胞数量降低并影响下一代胰腺的发育；瘦素(1eptin)基因启动子区

    的去甲基化与脂肪细胞前体分化为脂肪细胞的过程紧密相关；在衰老过

    程中，随时问推移不断积累的DNA甲基化错误可能会通过降低某些基因

    的反应度而加速2型糖尿病的发展。此外，研究发现糖尿病和肥胖是与

    基因组印记变化密切相关的疾病。在营养物质代谢调节和出生后发育过

    程中，印记基因可能具有不同的作用。如剔除鸟嘌呤核苷酸结合蛋白

    Gsa亚基的父系与母系等位基因对能量代谢产生相反的影响：父系功能

    的丢失表现肥胖倾向的降低、代谢功能亢进、血糖过低、运动能力下降

    以及对甲状旁腺素拮抗，而母系功能的丢失则表现为更严重的肥胖倾

    向。

    九、表观遗传学与自身免疫性疾病

    表观遗传调节异常在自身免疫性疾病的形成过程中也有重要作用。

    研究较多的是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。

    研究表明，SLE患者的T淋巴细胞可通过DNA低甲基化机制过度表达一

    些致病细胞因子和粘附分子，进而参与SLE发生发展过程中的细胞和体

    液免疫紊乱，导致多系统的病理损伤。DNA低甲基化促进共刺激分子

    CD40LG等的表达，使T细胞具有自身反应性，活化的T细胞一方面促使

    B细胞活化、分泌免疫球蛋白；另一方面，大量杀伤巨噬细胞，增加血

    液循环中的自身抗原，削弱对免疫复合物的清除。两者相互促进，便产

    生了大量针对自身抗原的抗体。SLE患者的T细胞还存在不同程度DNA

    甲基转移酶(DNMT)的活性及表达水平下降，这可能与有丝分裂原活

    化蛋白激酶(MApK)途径相关。DNA低甲基化重新激活原已失活的X

    染色体是女性易患SLE的重要原因。此外，人类基因组中包含了大量的

    逆转录病毒序列，研究证明人类内源性逆转录病毒(human endogenous

    retroviruses，hERV)是引起许多自身免疫性疾病的一个原因。SLE患者

    因DNMT表达的减少导致低甲基化，增加了hERV基因的转录，而hERV

    的表达可能促进针对凋亡核碎片的抗DNA抗体的产生，从而参与了疾病

    的发生和进展。

    类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者基因组普遍存在

    DNA甲基化水平降低，目前认为低甲基化水平可能与N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因的突变和高同型半胱氨酸血症有关。此外，DNA甲

    基化异常也被发现与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)和系

    统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)等相关。

    十、表观遗传学与肿瘤

    过去人们一直认为基因突变对肿瘤的形成具有非常重要的作用，并

    相继发现了许多癌基因和抑制基因。随着半个世纪的不断深入研究，越

    来越多的证据表明异常遗传和表观遗传的因素综合作用，共同导致癌症

    的发生。肿瘤表观遗传学机制贯穿肿瘤发生、发展的整个过程，并具有

    一定的广泛性和组织特异性。

    通过对DNA甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的

    DNA甲基化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增

    加；组织特异性基因的启动子区域出现重新甲基化；癌基因多为不充分

    甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化，从而表

    达受抑制。其中，关于肿瘤抑癌基因失活与该基因启动子区(CpG岛)

    的过度甲基化有大量的报道。许多与细胞生长增殖相关的基因，如与细

    胞周期相关的基因RB1、CDKN2A、CDKN2B和p73，以及与DNA损伤

    修复有关的基因，如BRCA1和MLh1等，它们启动子区域的异常甲基化

    都与该基因的失活有关。因此，用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗肿瘤备

    受关注——通过抑制剂降低甲基化水平来恢复抑癌基因的活性。但是这

    种非特异性的广泛改变可能会同时造成基因组的不稳定，并增加其他组

    织罹患癌症的风险，因而仍需深入研究。

    肿瘤中另一个重要的表观遗传改变就是组蛋白的修饰。与DNA甲基

    化相比，组蛋白修饰相对更为复杂，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛

    素化、糖基化、ADp核糖基化等，它们之间还能组成“组蛋白密码”共同

    发挥作用。目前对乙酰化、甲基化及相应的修饰酶和去修饰酶在肿瘤中

    的作用研究较多。抑制组蛋白去乙酰化酶hDAC的活性可防止组蛋白的

    过度低乙酰化，进而可引起抑癌基因表达水平增加，达到抑制肿瘤细胞

    增殖或诱导凋亡的目的。而组蛋白甲基化对肿瘤的影响则更为复杂，不

    同甲基化位点及不同甲基化修饰程度可能引起基因表达活化或抑制，从

    而作用于肿瘤的发生发展过程。此外，组蛋白修饰还能与DNA甲基化等

    表观遗传调控方式发生相互作用。总之，组蛋白修饰的复杂调控机制及

    对肿瘤的影响还有很多未知内容需要进一步研究。一些具体实例可参

    见“组蛋白修饰与人类疾病”相关内容。第4章 表观遗传学研究策略与技术

    在过去的50年中，遗传学相关技术的突飞猛进推动着基因组学乃至

    生命科学的高速发展，出现了一系列遗传学和基因组学研究的新技术和

    新方法。而表观遗传学的诞生也离不开这些研究技术的进展，并进一步

    促进了表观遗传学生物信息分析、基因表达谱分析、表观基因组分析、DNA甲基化分析、组蛋白修饰分析、染色质重塑分析、RNA组学研

    究、RNA拼接图谱综合分析等专用技术和方法的发展。

    在表观遗传学研究中，很多研究者把目光聚焦在DNA甲基化、组蛋

    白修饰和非编码RNA上，这几种相互关联和相互作用的分子机制和很多

    表观遗传现象相关。遗传学和表观遗传学作为遗传学研究的两个主要领

    域，在分析技术方面有许多交叉，可以相互借用。以下简单介绍一些应

    用较为广泛的研究技术。

    一、表观遗传生物信息学分析和数据库

    人类表观基因组协会(humnan Epigenome Consortium，hEC)在

    2003年10月正式宣布开始实施人类表观基因组计划(human epigenome

    proiect，hEp)，通过大规模检测人类基因组中的甲基化位点，并确

    定、分类和解释人类主要组织中所有基因的DNA甲基化模式，建立人类

    基因组甲基化可变位点(methylation variable positions，MVp)图谱的

    数据库。由于不同的组织类型具有各自的MVp，因此hEp所产生的数据

    并不是唯一的，而是多样的。不同组织类型和疾病状态的同一段基因序

    列均有其各自的MVp特征。除DNA甲基化信息以外，MVp分析数据库

    还提供染色体坐标(chromosome coordinates)、CpG岛、单核苷酸多态

    性(single nucleotide polymorphisms，SNp)和基因转录等信息。

    二、DNA甲基化修饰研究技术

    DNA甲基化是表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。近些

    年，随着DNA甲基化研究的深入，相关分析方法层出不穷，按其原理不

    同可主要分为依赖于甲基化敏感的限制性内切酶技术、依赖于DNA序列

    分析的检测技术和依赖于甲基化芯片、质谱的检测技术等。

    1.依赖于甲基化敏感的限制性内切酶技术

    (1)甲基化敏感的限制性指纹(methy1ation-sensitive restriction

    fingerprinting，MSRF)技术

    MSRF方法结合了限制性酶切和pCR技术，可以从基因组水平筛选

    差异的甲基化片段。该方法用DNA甲基化非敏感性和敏感性内切酶，如

    Mse I和BstU I，并采用随机引物扩增差异甲基化片段。优点是几乎可以检测全基因组所有CpG岛，但需进行大量的pCR扩增，操作过程较为繁

    琐。目前，该方法主要被用于筛选新的差异甲基化片段，然后对其进行

    后续鉴定，进一步确认差异甲基化片段与基因转录间的关系。

    (2)限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic

    scanning，RLGS)

    RLGS联合使用了限制性内切酶及二维电泳技术。其过程是：先用

    甲基化敏感的限制性内切酶Not I消化基因组DNA。由于Not I的作用可

    被重叠的CpG甲基化阻断，因而可以使得CpG岛的甲基化位点被保留。

    然后用同位素进行末端标记，再经甲基化不敏感的酶如EcoRV进行切

    割，进行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶，如hinf I

    切割，进行二维电泳。这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显示出条

    带。然后将RLGS图谱与正常对照比较，得出的缺失条带即为甲基化的

    可能部位。该方法可用于分析特定肿瘤中异常甲基化的改变，还可同时

    分析不同肿瘤中甲基化模式的异同和寻找肿瘤内DNA甲基化的新靶点。

    由于新发现甲基化靶点的作用尚不清楚，因此需要后续进一步分析确

    定。此外，RLGS图谱不能完全确认所缺失的片段是由于甲基化所致还

    是由于DNA本身缺失所致，其结果相对比较复杂，不易分析和解释。

    (3)甲基化间区位点扩增(amplification of intermethylated sites，AIMS)

    AIMS采用甲基化敏感和甲基化不敏感的同裂酶(isoschizomer)裂

    解以及接头引物扩增甲基化间区序列。此方法可通过改变接头引物的序

    列控制扩增带的复杂程度，且所得片段在200～2000bp之间，可以直接

    克隆到载体并测序。其优点是简单方便，可以作为差异印记基因筛选的

    有效工具。

    (4)CpG岛扩增结合代表性差异分析技术(methylation CpG island

    amplification-representational difference analysis，MCA-RDA)

    MCA-RDA是一种有效的全基因组甲基化分析技术，该方法能鉴定

    并克隆出不同样本间差异的甲基化片段。MCA结合RDA是基于pCR扩

    增分析不同组织之间甲基化分布差异的一种高通量的分析方法。利用甲

    基化敏感和非敏感的两种限制性内切酶消化基因组DNA，然后与相应的

    接头连接，用pCR把基因组中的甲基化DNA片段进行特异性扩增，从而

    达到富集整个基因组甲基化片段的目的。在此基础上，运用RDA分析，把检测子和驱赶子的甲基化差异序列得到富集。MCA-RDA是一种能有

    效分离两种组织间差异甲基化片段的高通量方法，其主要缺点是不能同

    时比较多个样本以及不能分离出差异的低甲基化片段。2.依赖于DNA序列分析的检测技术

    (1)结合焦磷酸测序技术的发光法甲基化分析

    焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术。

    该技术无须进行电泳，而是通过焦磷酸基团(ppi)转化为可见光信

    号，也无须对DNA片段进行荧光标记，操作非常简便。将其用于全基因

    组甲基化分析主要是利用甲基化敏感的酶hap Ⅱ和甲基化不敏感的酶

    MspⅠ将基因组DNA进行酶切，再进行焦磷酸测序。通过比较非甲基化

    CG和甲基化CG所代表的峰即可检测整个基因组的甲基化水平。该方法

    不需对基因组DNA进行修饰，耗时较短，适合临床标本的分析，但焦磷

    酸测序技术的测序长度有限而且价格昂贵。

    (2)亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法(bisulfite sequencing)

    到目前为止，直接测序法仍然是DNA甲基化检测的金指标。该方法

    可以检测给定区域内每个CpG位点的甲基化状态以及频率。一般过程如

    下：亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，然后在所研究的CpG位点两侧设计引物进

    行pCR扩增，最后对pCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判

    断CpG位点是否发生甲基化。此方法可靠性及精确度很高，能明确目的

    片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较

    为繁琐且价格昂贵。

    3.依赖于甲基化芯片、质谱的检测技术

    (1)基于CpG岛芯片的差异甲基化杂交(differential methylation

    hybridization using CGI array，DMh)

    DMh法是基于甲基化敏感的限制性内切酶和Linker-pCR技术的差式

    杂交法，能够快速简捷地富集高甲基化的CpG岛。目前该方法被广泛用

    于筛选肿瘤中启动子区发生异常甲基化的基因。该方法主要过程如下：

    基因组DNA用MseⅠ酶切成小片段，但保留CpG岛的完整性，即获得富

    含CpG岛的酶切片段，经亲和层析柱富集，克隆至文库构建载体中，含

    多个BstUⅠ酶切位点的CpG岛克隆被选择，扩增后点制成高密度微矩

    阵。目标组织和细胞基因组DNA经BstUⅠ酶切，与Linker连接，进行

    Linker-pCR，待比较的两个样本分别标记Cy3和Cy5，与CGI芯片进行杂

    交，通过比较荧光强度即可获知两样本间甲基化状态的差异。该方法可

    用于多样本、多位点甲基化的检测，样本需要量少，适用于临床样本，但存在假阳性问题，需进行后续鉴定。

    (2)甲基化寡核苷酸芯片法(methylation specific oligonucleotide，MSO)该方法利用直接杂交原理，只是在标记前先用亚硫酸氢钠处理

    DNA，从而使所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶

    并不受该处理的影响。MSO是一种基于基因芯片的高通量的甲基化检测

    方法，可同时比较多个样本间特定位点的甲基化状态改变，但该方法无

    法确定所研究CpG岛的甲基化模式，一般针对已知的个别基因的调控区

    进行研究，不能对大量基因尤其是未知基因进行甲基化分析。另外，该

    方法需要起始的基因组DNA量为2~3g，其成功与否主要取决于特异性

    寡核苷酸探针的设计，而重复性好坏则主要取决于亚硫酸氢盐修饰。

    (3)染色质免疫共沉淀和芯片结合技术(ChIp-on-Chip)

    利用抗5-甲基胞嘧啶的抗体进行染色质免疫共沉淀，富集高甲基化

    的DNA片段，该过程称为甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIp)。然后将

    经MeDIp富集的DNA片段与CpG岛芯片进行杂交。该方法可同时检测整

    个基因组和特定位点的甲基化状态，但价格较昂贵。

    (4)质谱技术

    将基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后用一条含T7启动子的引物和一

    条C含量较高的引物进行pCR扩增，则扩增出的pCR产物带有T7启动子

    标签和一段富含C的控制标签。然后将上述pCR产物进行体外转录成

    RNA，RNA经RNase T1酶切后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

    (matrix assisted laser desorptionionization-time of flight mass

    spectrometry，MALDI-TOF-MS)检测。该方法通量高，可用于全基因

    组甲基化水平和特定CpG位点甲基化状态的测定。

    三、组蛋白修饰研究技术

    以抗体为基础的蛋白质分析技术，如Western blot、免疫共沉淀、pull-down等被广泛应用于对组蛋白修饰的研究。此外，染色质免疫共沉

    淀(ChIp)、质谱技术和蛋白质芯片也在相关研究中发挥重要作用。

    四、非编码RNA研究技术

    目前非编码RNA的工作主要分为两个方面：一是大规模鉴定新的非

    编码RNA；二是通过各种方法研究非编码RNA的功能。大规模鉴定非

    编码RNA的方法可以分为用理论预测和实验发现两种。前者主要是借助

    计算机，从已有的非编码RNA中提取特征信息，然后以特征信息做全基

    因组搜索。目前比较成功的预测软件有：预测snoRNA的snoScan和

    snoGpS，预测tRNA的tRNAScan，预测microRNA的mirScan等。理论预

    测方法简便快捷，可为深入研究提供重要的线索和依据，但是最终确定

    仍然需要实验证明，因此理论预测与实验验证通常是相辅相成的。利用

    实验鉴定非编码RNA的方法被称作“RNomics”，其核心在于构建非编码RNA的cDNA文库。目前很多商业化公司都推出了可用于构建非编码

    RNA相应cDNA文库的试剂盒。得到非编码RNA的cDNA文库以后，可

    用传统的克隆测序法或新近发展的直接测序法对文库中的非编码RNA进

    行鉴定。此外，2000年以后发展起来的全基因组tiling芯片技术目前的应

    用也越来越广泛。这种技术的核心在于构建高密度的覆盖全基因组的芯

    片。其优点在于不用构建cDNA文库，更不用做克隆，只要有分离纯化

    的非编码RNA就可以检测，操作简单，成本很低，可以检测到大量低丰

    度的非编码RNA。其缺点在于不能准确的确定非编码RNA的转录起始

    和终止位点，也很难区分剪切加工产物。非编码RNA的功能研究目前主

    要集中在microRNA 和siRNA，主要原因在于这两种小RNA的作用方式

    都是通过同目标基因进行碱基配对，因此寻找作用靶点相对较容易；而

    对于长的非编码RNA来讲，它们往往要形成复杂的二级甚至是三级结

    构，预测其靶点相对比较困难。第5章 细胞因子的种类、特性和功能

    目前对细胞因子公认分类主要有白介素(interleukin，IL )、肿瘤

    坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干扰素(interfeon，IFN)、生长因子(growth factor)、趋化因子(chemokine)、集落刺激因子

    (colony stimulating factor，CSF)、神经营养因子(neurotrophin，NT)等。下面就介绍几类主要的细胞因子。

    一、白介素

    白介素(IL)原来是指一类介导白细胞之间相互作用的物质，按其

    发现的先后以阿拉伯数字排序，目前报道的已有IL-l到IL-18。

    二、肿瘤坏死因子

    肿瘤坏死因子(TNF)有两种形式：TNF-α和TNF-β。前者是由巨

    噬细胞产生的，后者是由T细胞产生的，又称淋巴毒素(lymphotoxin，LT)。

    TNF-α由151个氨基酸残基组成，相对分子质量为17000；TNF-β由

    171个氨基酸残基组成，相对分子质量为25000。两者结合的受体相同，生物学功能亦相同。

    TNF-α主要由激活的单核巨噬细胞产生，T、B、NK细胞也能分泌

    TNF-α；TNF-β由活化的T细胞产生，主要是Th0和Thl细胞，而Th2细胞

    不分泌。

    TNF的主要生物学功能：(1)抑制肿瘤细胞和病毒感染细胞生长

    及细胞毒作用；(2)激活中性粒细胞、巨噬细胞，增强其吞噬功能；

    (3)增强T、B细胞对抗原和丝裂原刺激的增殖反应；(4)诱导血管

    内皮细胞促进凝血，分泌IL-1、IL-6、CSF等；(5)致热原、低血压和

    促炎反应；(6)促进肌肉、脂质分解，引起恶液质。

    三、干扰素

    干扰素(IFN)按抗原性分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN-α至少又

    可分为24种亚型；IFN-β有β1和β2两种亚型(IFN-β2即IL-6，无抗病毒活

    性)。根据IFN的受体结合特性，又可将IFN分为I型(α、β和ω)和Ⅱ

    型(γ)。IFN-α由165～166个氨基酸残基组成，相对分子质量为

    15000~20000；IFN-β由166个氨基酸残基组成，相对分子质量为

    22000~23000；IFN-γ由146个氨基酸残基组成，相对分子质量为

    20000(二聚体为40)。

    IFN-α主要由白细胞、B细胞产生；IFN-β主要由二倍体成纤维细胞产生；IFN-γ则由活化的CD十8T细胞及Thl和Th0细胞产生。

    Ⅰ型IFN的生物学功能：(1)抗病毒作用。IFN-α、IFN-β具有广谱

    抗病毒作用，它们并不直接杀灭病毒，而诱导宿主细胞产生多种酶来干

    扰病毒复制的各个环节，如病毒吸附、脱壳、核酸转录、蛋白合成、成

    熟释放等。(2)抑制某些细胞生长，如成纤维细胞、上皮细胞、内皮

    细胞和造血细胞等，可能机制为下调c-myc，c-fos和生长因子受体表

    达，使细胞停滞于G0G1期。(3)免疫调节作用。诱导主要组织相容

    性复合物(MhC)Ⅰ类分子表达，增强NK和Tc细胞的活性。(4)抗肿

    瘤作用。可能的机制为直接抑制肿瘤细胞生长，增强抗肿瘤免疫及改变

    宿主和肿瘤的关系。

    Ⅱ型IFN的生物学功能主要为免疫调节作用，抗病毒作用较弱：

    (1)上调MhC Ⅰ类和Ⅱ类分子表达；(2)活化巨噬细胞；(3)增强

    Tc和NK细胞活性，协同IL-2诱导LAK细胞；(4)上调血管内皮细胞表

    达ICAM-1(CD54)，促进淋巴细胞穿透血管进入炎区；(5)促进B和

    Tc细胞分化，并增强活性，抑制Th2细胞和IL-4产生并抑制IL-4活性；

    (6)促进B细胞分泌IgG2a，抑制IgGl、IgG2b、IgG3、IgE的产生。

    四、生长因子

    生长因子是血液和组织自身形成的多肽物质，通过与特定细胞表面

    受体结合把愈合所必需的物质聚集到创伤部位(趋化作用)，并诱导新

    细胞增殖，促进创伤愈合，同时还具有许多其他的效应。以下介绍部分

    生长因子及其特性、作用。

    1.表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)

    小鼠EGF(mEGF)是最早发现的生长因子，含53个氨基酸残基的

    单链多肽，相对分子质量为6045000，有3个二硫键。

    人EGF(hEGF)与mEGF生物学活性及抗原性相同，但理化性质不

    同，主要由十二指肠腺、颌下腺创伤并由血小板和巨噬细胞释放，存在

    于几乎所有的体液中。

    EGF通过细胞膜上的EGF受体(EGFR)发挥作用：主要是促进细

    胞增殖，并在细胞分化、新生血管形成和胚胎细胞生长方面也起一定作

    用。作用方式：(1)由多种组织细胞分泌，而不是由特殊腺体分泌；

    (2)靶细胞谱广，无特异性靶细胞；(3)通过旁分泌、自分泌和内分

    泌方式产生；(4)EGFR不仅具有受体功能，同时还具有激酶活性，能

    催化底物蛋白发生酪氨酸磷酸化。

    2.转化生长因子(transforming growth factor，TGF)TGF可分为五大类，其中研究较多的为TGF-α、β。

    (1)TGF-αTGF-α的结构和功能与EGF密切相关，两者的核苷酸序

    列有33%～44%的结构同源性，但TGF-α多肽比EGF少3个氨基酸，其受

    体亦为EGFR。故两者的作用亦相同。因此有人认为两者为同一亚家

    族。

    (2)TGF-βTGF-β有1～5种，即TGF-β1～TGF-β5，它们的氨基酸

    序列有78%~80%的同源性。TGF-β是由两个各含112个氨基酸的单体通

    过二硫键相连的同源二聚体，此为TGF-β的活性形式，相对分子质量为

    25000。

    几乎所有细胞均可分泌无活性的TGF-β前体蛋白。TGF-β存在于人

    和哺乳动物的多种正常体细胞、胚胎细胞、造血细胞中。

    TGF-β有3种受体：TGF-β-R I ，TGF-β-RⅡ和TGF-β-RⅢ，相对分

    子质量分别为53、70~80和300000。RⅠ和RⅡ与信号传导有关，RⅢ与

    TGF-β贮存有关。

    TGF-β的作用常表现出双向性：促进细胞在软琼脂上生长，刺激间

    质细胞单层生长，对细胞外基质的产生有明显促进作用，如能引起胶原

    蛋白、Fn增加；又是一个潜在的各种细胞的生长抑制剂，包括上皮细

    胞、内皮细胞、淋巴细胞、骨髓细胞等，这种抑制作用是可逆的。此

    外，TGF-β可能诱导某些细胞的凋亡。

    3.成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)

    FGF是体内分布最广的生长因子之一，有碱性(bFGF)和酸性

    (aFGF)两大类。它们的分子结构相似，约有53%的氨基酸序列相

    同，两者均为不含糖的16000多肽。bFGF分布较广，存在于血管内皮、血管平滑肌、心肌细胞以及富含血管的组织中；aFGF分布相对局限。

    FGF的受体有两类，一类为高亲和力酪氨酸蛋白激酶类受体，另一类为

    低亲和力肝素样受体。FGF在低浓度(1μgml)就能起作用，且作用广

    泛，能影响多种细胞的生长和分化，还具有促有丝分裂作用。

    4.胰岛素样生长因子(insulin-like growth faetor，IGF)

    IGF是一类生长激素(Gh)依赖性生长因子，其分子结构与胰岛素

    原相似。IGF有两种，即IGF-1和IGF-2，前者主要存在于成人，后者存

    在于胎儿。IGF由肝脏分泌，在血清中有较高的浓度，以自分泌、旁分

    泌和内分泌方式起作用，Gh对其起重要调节作用。

    IGF-1由70个氨基酸组成，相对分子质量为7649，血中IGF-1下移

    95%～99%与IGF结合蛋白(IGFBp)结合，并失去活性。游离型IGF-1为主要活性形式，结合和游离的IGF-1可相互转化。已知IGFBp至少有6

    种，与IGF有高度亲和力。

    IGF的作用由其受体介导，包括：①促进生长，Gh的大部分促生长

    活性是由IGF-1介导完成；②促物质代谢，IGF-1能抑制胰岛素、C肽、胰高血糖素及Gh水平，抑制肝糖输出，降低血中游离脂肪酸、氨基酸

    水平；③促细胞分裂增殖，促进成纤维细胞复制，使成骨细胞和肌细胞

    进入高分化状态，还可能促进肾脏合成促红细胞生成素、神经轴突生

    长、肾基底膜蛋白合成、卵细胞成熟，刺激血管内皮细胞及平滑肌细胞

    增殖等作用。

    5.血小板源性生长因子(platelet-derive growth factor，pDGF)

    pDGF为一血小板释放物质，在血液凝固时由血小板α颗粒释放，是

    血液中细胞分裂素的重要来源。相对分子质量为30000，属阴离子糖蛋

    白，有AB两条链，可组成pDGF-AA、pDGF-AB、pDGF-BB三种异构

    体，它们以不同的亲和力和特性与细胞表面受体结合，并发挥作用。其

    中以pDGF-BB作用最强。人主要为pDGF-AB。

    pDG F的作用主要有两方面，一是对白细胞和成纤维细胞的趋化

    性；二是促分裂特性，促进纤维形成的连续过程。此外，pDGF可与其

    他因子协同作用，从而发挥其生理功能。在损伤愈合中，它亦是具有重

    要作用的生长因子之一。

    五、趋化因子

    趋化因子为一超家族成员，根据其结构不同可分为3个亚族：CXC

    亚族，又称α类；CC亚族，又称β类；C亚族，又称γ类。CXC亚族的分

    子特征为：氨基末端的4个半胱氨酸残基的前两个被一非保守氨基酸残

    基分隔开；CC亚族的氨基末端的4个半胱氨酸为并列连接；C亚族有一

    单独的氨基末端半胱氨酸。编码CXC亚族的基因群集于人类4号染色体

    长臂，其氨基酸水平的同源性为20%～50%；编码CC亚族的基因群集

    于人17号染色体，氨基酸水平的同源性为28%～45%；C亚族基因定位

    于人1号染色体。这三类趋化因子亚族的同源性约为20%～40%。

    已发现许多细胞能产生趋化因子，包括单核细胞、肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、NK细

    胞、角化细胞、肾小球膜细胞、上皮细胞、肝细胞、成纤维细胞、平滑

    肌细胞、间皮细胞和内皮细胞等。这些细胞在同各种因子如病毒、细菌

    产物、IL-1，TNF，C5a、LTB4和IFNs反应时产生趋化因子。第6章 细胞因子与肺部疾病

    一、细胞因子与哮喘

    支气管哮喘是以气道炎症和气道高反应性为主要特征的慢性非特异

    性炎症疾病。在这个疾病过程中，免疫细胞和炎性细胞在气道组织中的

    浸润(聚集、激活和释放)是主要的发病学特征，而在这些细胞浸润的

    整个过程中，细胞因子都起了很重要的作用。

    1.白介素-4(IL-4)与哮喘

    研究表明，过敏性哮喘的发生离不开Th2细胞所分泌的细胞因子的

    重要作用。Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，它们作用于抗

    体生成和过敏反应过程。而Thl细胞主要产生IL-2、TNF-β和IFN-γ，它

    们作用于迟发型超敏反应和提高细胞毒性。Thl和Th2均能产生IL-3和

    GM-GSF。在哮喘反应中，IL-3、IL-5、GM-CSF和IL-4的作用最为突

    出，其中又以IL-4的作用显得最为重要，主要表现在以下几个方面：

    (1)诱导IgE的产生

    IgE在支气管哮喘的发病中是一个重要的关键因素。气道高反应的

    机制之一是IgE依赖性的肥大细胞脱颗粒。IgE通过与多种炎症细胞的高

    亲和力和(或)低亲和力抗体结合，在过敏原的诱导下，引发这些细胞

    释放各种炎症介质。而IL-4在过敏原诱导IgE产生中起着必要的中间介

    导作用。小鼠的体外实验证实，IL4是B细胞产生IgE所需要的唯一必需

    因子。在缺乏IL-4的小鼠体内，T、B细胞发育正常，而产生IgE的功能

    障碍。对于经免疫的IL-4缺乏小鼠，由于其肥大细胞和携带低亲和力

    IgE受体的炎症细胞未被致敏，因此，在由5-羟色胺引发的支气管反应

    中，抗原诱导IgE的升高将消失。在过敏性气道炎症和高反应鼠类模型

    中观察到，Th细胞直接控制抗原诱导的气道高反应。体内Th2反应的发

    生和Th2细胞介导的特定组织炎症均需要IL-4，因此IL-4的缺损可造成支

    气管中Th2反应的减弱，导致过敏性气道炎症的消弱和过敏原诱导支气

    管高反应能力的丧失。

    (2)诱导CD23表达

    CD23即低亲和力IgE受体(FcεRⅡ)，是相对分子质量为45000的

    糖蛋白，其有两种亚型——FcεRⅡα和FcεRⅡβ，它们分别由B细胞和单

    核细胞表达。CD23可插入IgE结合因子(为一种可溶性片段)而组成多

    功能分子，实现对IgE合成、B细胞自分泌生长和胸腺细胞成熟的调控。

    已确定，人重组IL-4是正常人单核细胞CD23的重要诱导物。在过敏性病

    人中，IL-4对B细胞和单核细胞表达和合成CD23均具有调控作用。IL-4可同时诱导哮喘病人和正常人单核细胞CD23的表达增加。IL-4能提高B

    细胞和巨噬细胞(Mф)中CD23的表达水平，这可说明为什么哮喘病人

    肺泡巨噬细胞CD23的表达量是增多的。由于巨噬细胞具有CD23，而且

    能以一种依赖IgE的方式被激活，并分泌各种炎症介质，如血栓素

    A2(TXA2)、前列腺素D2(pGD2)、白三烯B4(LTB4)以及TNF和

    IL-1等细胞因子，因此，巨噬细胞是一种重要的哮喘初始细胞。IL-4能

    维持高水平的CD23，而后者在过敏性疾病中对巨噬细胞分泌炎症介质

    起了至关重要的介导作用。可见IL-4在哮喘发病中的重要性。

    (3)诱导嗜酸性粒细胞聚集

    研究发现给小鼠腹腔注射IL-4可导致嗜酸性粒细胞的聚集，而皮下

    注射IL-4则可诱导嗜酸性粒细胞特征性浸润。在过敏性炎症中也发现IL-

    4可诱导嗜酸性粒细胞迁移。已知IL-5能启动嗜酸性粒细胞的生长和分

    化，它与IL-3和GM-CSF同称为嗜酸性粒细胞分化因子。在IL-4缺乏的

    小鼠中观察到，CD十4细胞经刺激后，IL-5和IL-10产生明显减少，并出

    现IL-5依赖性的嗜酸性粒细胞聚集作用减弱，表明IL-5的作用依赖于IL-

    4。

    (4)诱导血管细胞间粘附分子-1的表达

    血管细胞间粘附分子-1(VCAM-1)由内皮细胞合成，位于细胞表

    面，其作用为介导嗜酸性和嗜碱性粒细胞等具有粘附受体的细胞粘附于

    内皮细胞。近年来，粘附分子在哮喘发病中的作用日益受到重视，IL-4

    可提高内皮细胞VCAM-1的表达，因此可加强嗜酸性和嗜碱性粒细胞对

    内皮细胞的粘附介导作用。VCAM-1的受体是整合素VLA-4(α4β1)，后者可在T、B细胞和单核细胞大量表达，以促进淋巴细胞与活化的内

    皮细胞粘附。

    (5)调控Th2的定向分化

    前已述及，Th2细胞在哮喘中的作用是必不可少的。IL-4是使幼稚T

    细胞(Th0)定向分化为Th2细胞的唯一调控因子。因此，没有IL-4，Th0就不能定向分化为Th2细胞，因此也不能产生在哮喘发病中起重要

    作用的各种Th2细胞因子。对IL-4缺乏小鼠的体外刺激研究发现，CD十

    4T细胞分泌IL-5和IL-10明显减少，并导致IL-5依赖性的嗜酸性粒细胞聚

    集作用明显减弱，这表明Th2细胞的定向分化受到阻遏。

    (6)诱导Th2细胞，抑制Thl细胞

    在Th1和Th2细胞间存在相互制约机制。IL-4促进Th2细胞的发育和

    分化，同时抑制Th1细胞的效应能力。Th1细胞的分化能被IFN-γ、TNR-

    β和IL-12诱导，并产生Thl细胞因子。IFN-γ能抑制Th2细胞的分化发育，同时刺激Th1产生更多的IFN-γ，产生放大效应。IFN-γ和IL-12有助于

    Th1细胞的产生和维持，并阻碍Th2引发的过敏反应。然而在调控气道

    黏膜Th2的免疫反应中，IL-4和IL-5比IFN-γ更为重要。此外，IL-4和IL-

    10可抑制Th1的增殖和功能，特别是抑制IFN-γ的产生及其效应。

    2.白介素-8(IL-8)与哮喘

    IL-8属趋化因子超家族成员，其功能为通过靶细胞表面的IL-8受体

    实现对靶细胞的趋化作用。在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细

    胞、单核细胞、肿瘤浸润细胞和嗜碱性粒细胞表面均有IL-8受体的表

    达。因此在以气道炎症和高敏反应为特征的哮喘中，IL-8的作用理所当

    然地受到了人们的重视。

    (1)哮喘患者IL-8水平升高

    许多研究证实，正常人、无哮喘的过敏体质者与哮喘患者相比，后

    者的痰液、鼻腔灌洗液和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-8水平明

    显高于前两者，并且近期常发作者远高于近期少发作者，正在发作者高

    于未发作者。而过敏体质者与正常人之间无明显差异。对哮喘患者的

    BALF成分分析发现，IL-8的水平较对照组高出几乎8倍以上。还发现，BALF中的嗜酸性粒细胞数目显著增多，且与IL-8浓度呈正相关。当哮

    喘患者接触臭氧或者病毒感染后，在出现第一秒用力肺活量降低、气道

    阻力增加及哮喘症状的同时，BALF中IL-8浓度亦明显升高，表明IL-8与

    哮喘发作存在密切关系。

    (2)哮喘患者IL-8的来源

    哮喘患者发病过程中，IL-8显著升高的来源有以下几个途径：①支

    气管上皮细胞：支气管上皮细胞长期以来一直被认为是炎症细胞的靶细

    胞而不具有任何效应。然而，最近的资料表明，动物和人类支气管上皮

    细胞能产生炎症细胞趋化因子和影响粒细胞及B、T细胞激活的因子。

    哮喘患者的支气管黏膜活检标本及BALF中的支气管上皮细胞的免疫组

    化染色发现，细胞内存在IL-8蛋白，且阳性率明显高于正常人。当支气

    管上皮细胞同IL-1β、TNF-α、弹性蛋白酶、组胺共同孵育时，可使支气

    管上皮细胞IL-8的释放量明显增加。此外，在IL-1β存在下，支气管上皮

    细胞可产生对中性粒细胞的趋化活性，并且这种趋化活性可被IL-8单抗

    所抑制，这表明支气管上皮细胞对中性粒细胞趋化的效应是由IL-1β诱

    导支气管上皮细胞分泌IL-8而实现的。②肺泡巨噬细胞、单核细胞。在

    体外培养的肺泡巨噬细胞和外周血单核细胞的培养上清中发现有IL-8存

    在。这两种细胞受到脂多糖(LpS)的刺激时，可使哮喘病人的IL-8的

    分泌量显著高于正常人。③肥大细胞。用不成熟型肥大细胞hACL细胞刺激肥大细胞，可使肥大细胞中IL-8mRNA在刺激后1h开始表达，并可

    持续48h，并证实这种作用是直接的，而不是通过其他新合成的蛋白质

    间接起作用的。IL-8mRNA 48h持续表达表明了IL-8mRNA的稳定性和

    mRNA降解酶的抑制。此外，激活肥大细胞表面的腺昔A2b受体，可导

    致肥大细胞释放IL-8。④嗜酸性粒细胞。在哮喘患者的外周血嗜酸性粒

    细胞中IL-8和IL-8mRNA表达均见上调。在用GM-CSF、RANTES或血小

    板激活因子(pAF)、phA刺激嗜酸性粒细胞后，可发现后者释放IL-8

    明显增加，且在哮喘后更为显著。

    (3)IL-8在哮喘发病中的作用

    ①IL-8可诱导支气管平滑肌痉挛，其作用机制可能是IL-8通过激活

    中性粒细胞而实现的。IL-8对中性粒细胞具有显著的趋化活性，并对中

    性粒细胞的全程反应均有诱导和易化作用，包括：活化4-磷脂酰肌醇激

    酶，激活中性粒细胞微丝，促进其游走；诱导中性粒细胞发生形态改

    变，并表达表面粘附分子，加强其与内皮细胞的粘附，并促进其穿越内

    皮细胞；激活还原型辅酶l(NADph)氧化酶和磷脂酶A2；引发呼吸爆

    发，释放大量氧自由基和花生四烯酸代谢产物(pG、TB4等)，引起气

    道高反应和损伤；诱导中性粒细胞脱颗粒，释放蛋白水解酶，导致局部

    损伤。在由IL-8诱导的气道高反应患者的BALF和组织活检中，均以中

    性粒细胞为主。此外，在稳定型哮喘病人的BALF中，中性粒细胞所占

    比例与气道高反应程度呈正相关。中性粒细胞还可损伤气道上皮，引起

    上皮从基膜上脱落。②IL-8趋化嗜酸性粒细胞在气道黏膜聚集、浸润，嗜酸性粒细胞可释放阳离子蛋白(ECp)、毒性蛋白(ENp)。许多研

    究表明，在BALF中IL-8水平与ECp呈正比，因此IL-8在ECp的释放中起

    了诱导和促进作用。③IL-8具有组胺释放因子的作用，在IL-3存在时，IL-8可引起嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺和白三烯C4(LTC4)，介

    导一种不依赖于IgE的气道高反应。④IL-8可引起呼吸膜通透性增加。

    以BALF血清的α2微球蛋白比值作为呼吸膜通透性的参数，可发现IL-8

    与该比值呈明显正相关，表明IL-8在引起呼吸膜通透性增高中起重要作

    用。

    3.白介素-10(IL-10)与哮喘

    IL-10在哮喘中的作用与上述其他细胞因子不同，对哮喘的发生发

    展有负调控作用。

    (1)IL-10在哮喘发病中的作用

    IL-10能抑制多种细胞合成其他细胞因子，对哮喘的治疗、转归具

    有重要意义。IL-1是参与气道炎症反应的重要因子之一，主要来自气道及肺泡巨噬细胞，IL-10能促进骨髓单核细胞合成IL-1受体拮抗剂(IL-

    1RA)，在培养的骨髓单核细胞中加入IL-10可使其合成和释放IL-1RA

    的量比对照组高10倍。此外，IL-10可使IgE、内毒素等刺激肥大细胞合

    成和释放IL-6和TNF-α的能力明显削弱。IL-10还可抑制T淋巴细胞合成

    和释放IFN-γ。在哮喘患者的BALF中发现，IL-10水平显著低于正常

    人。哮喘患者的外周血单核细胞无论受到刺激与否，其合成和释放IL-

    10的量均低于正常人。RNA-pCR结果提示，迟发相哮喘反应中IL-10减

    少是由于IL-10mRNA转录受抑制所致。因此，哮喘患者体内合成和释放

    IL-10减少将导致炎症前细胞因子合成和释放增加，从而加重哮喘。此

    外，在哮喘患者的炎症局部，NO明显增多，尽管NO有舒张支气管平滑

    肌的作用，但过多的NO可使气道黏膜血管扩张，并产生自由基对气道

    造成更严重的损伤，而IL-10能明显抑制鼠巨噬细胞合成及释放NO，从

    而减轻气道炎症反应。

    (2)IL-10与哮喘的治疗

    糖皮质激素和茶碱用于哮喘的治疗已有数十年的历史，但两者的作

    用机制尚未完全明了。近年来的研究表明，低浓度糖皮质激素即可诱导

    人CD+44.5RO+幼稚型和CD+44.5RO+记忆型T细胞合成和释放大量IL-

    10，而IL-5、IFN-γ及IL-4浓度较低；而不使用糖皮质激素时，效应T细

    胞则产生大量的炎症前细胞因子，如IL-5及IFN-γ等。在哮喘患者外周血

    单核细胞培养体系中IL-10的浓度极低(0.35±0.08μgml)，而加入茶碱

    后，其浓度可升高至0.98±0.16μgmL。茶碱能明显抑制IFN-γ的产生和轻

    微抑制TNF-α的合成，这些均与IL-10有密切关系。这些资料表明，糖皮

    质激素和茶碱治疗哮喘的机制可能由IL-10来介导。

    4.白介素-6(IL-6)与哮喘

    IL-6是一种多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性，其代谢失调

    与多种疾病的发生有关。在症状性哮喘的患者，其支气管上皮细胞IL-6

    基因表达增加，培养上清中IL-6含量也明显增加，并且这种基因表达的

    上调作用可被糖皮质激素抑制。在非过敏性哮喘患者的BALF中IL-6水

    平较正常对照明显增高，且IL-6主要由气道非纤毛上皮细胞和(或)单

    核细胞产生，故认为，IL-6在局部产生增加，并在哮喘气道炎症反应中

    起重要作用。在支气管受过敏原刺激后发生迟发哮喘反应的患者，其肺

    泡巨噬细胞培养上清中的IL-6含量明显高于正常对照，且与TNF-α呈正

    相关。表明肺泡巨噬细胞经过敏原刺激后被激活，产生IL-6和其他细胞

    因子而参与气道炎症和迟发性哮喘的发生。

    5.趋化因子与哮喘参与哮喘的非特异性炎症反应的细胞主要有单核巨噬细胞、嗜酸性

    粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、气道上皮

    细胞和血小板等。不同亚族的趋化因子通过特异性调节不同炎症细胞的

    功能，影响哮喘的发生和发展。

    (1)CXC趋化因子的作用

    CXC的主要靶细胞为中性粒细胞，各趋化因子间的生物学效应虽有

    差异，如GRO-α对中性粒细胞的趋化活性为IL-8的10倍，但活化和诱导

    中性粒细胞脱颗粒反应的能力则不如IL-8。但总体来看均与IL-8相似，故详细情况请参见IL-8与哮喘。

    (2)CC趋化因子的作用

    CC趋化因子的主要靶细胞是单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜

    酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等。嗜酸性和嗜碱性粒细胞是参与哮喘变态

    反应性炎症的关键细胞。嗜酸性粒细胞在过敏性气道炎症中的聚集和激

    活已被认为是引起支气管膜膜损伤和气道阻塞的主要细胞。MIF-α、RANTES、eotaxin和MCp-3在体外是强烈的嗜酸性粒细胞趋化因子。在

    BALF中的嗜酸性粒细胞产物，包括主要碱性蛋白(MDp)、嗜酸性粒

    细胞阳离子蛋白(ECp)和嗜酸性粒细胞源性神经毒素(EDN)含量显

    著升高，可致气道高反应。嗜碱性粒细胞在变应原刺激下可释放组胺、LTs(B4、C4、D4、E4)和pGD2等炎症介质，引起支气管平滑肌痉挛

    和气道高反应，但在早期BALF中嗜碱性粒细胞并无变化，晚期则明显

    增加，且能持久地释放组胺，表明嗜碱性粒细胞在哮喘的晚期反应中起

    重要作用。MCR-1、MCR-2、MCR-3均可诱导单核巨噬细胞游走和浸

    润。MCp-1还可使单核巨噬细胞发生Ca2+超载，产生氧自由基，释放溶

    酶体酶，造成局部组织损伤。RANTES对未被活化的CD+4CD45RO+

    记忆T细胞和活化的未经抗原刺激的(naive)T细胞和记忆性T细胞均具

    趋化作用。MIp-1α对B细胞、细胞毒性T细胞及CD+4T细胞有趋化作

    用；MIR-lβ虽较MIp-1α作用弱，但可选择性趋化CD+4T细胞，尤其是

    naiveT细胞，并诱导T细胞粘附，淋巴细胞向炎症区聚集并被激活，启

    动变态反应性炎症反应。

    6.其他细胞因子与哮喘

    IL-3、IL-5和GM-CSF在哮喘炎性反应中的作用非常显著，哮喘患

    者的支气管黏膜、BALF及外周血中都有这3种细胞因子的水平升高。

    IL-3和IL-5能延长嗜酸性粒细胞的存活时间，促使嗜酸性粒细胞释放白

    三烯，增强其细胞毒性，并刺激嗜酸性粒细胞向活化型转化，诱导其向

    炎症部位聚集，发挥病理损伤效应。此外，IL-3和GM-CSF不但作用于嗜酸性粒细胞，而且作用于中性粒细胞和肥大细胞。这些细胞因子对嗜

    酸性粒细胞及其他炎症细胞反应的调控作用，是哮喘发病过程中的重要

    免疫事件，是启动哮喘气道炎症并使其持续存在的关键因素。

    二、细胞因子与急性呼吸窘迫综合征

    急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种以急性弥漫性肺实质(主要

    为肺泡膜)损伤为特征的综合征，发病机制错综复杂，临床表现主要为

    肺顺应性下降和难以纠正的进行性低氧血症，平均死亡率高达50%～

    60%。近年来，炎症介质，尤其是细胞因子在ARDS发病中的作用日益

    受到重视，其中TNF和IL-1、IL-6、IL-8在ARDS发病中的作用尤为重

    要。IL-8是新近被更为关注的与ARDS发病密切相关的细胞因子。

    1.ARDS时IL-8的水平变化

    许多研究资料表明，ARDS患者的血浆和BALF中的IL-8水平均明显

    升高，但也有报道不升高的。IL-8水平在ARDS中缺乏特导性，如ARDS

    和肺炎患者IL-8均升高，而以ARDS伴肺炎者更高。ARDS患者与非

    ARDS患者之间IL-8水平差异无统计学意义。在ARDS晚期，血IL-8与

    BALF IL-8水平相平行，但后者高于前者，这是由于肺局部产生IL-8占

    优势所致。对一组ARDS患者的临床研究显示，ARDS患者BALF IL-8高

    达521±484pgmL，正常对照为32±29pgmL，而慢性阻塞性肺部疾病

    (COpD)对照组为7±10pgmL，ARDS组较对照组增高(p<0.002)。

    ARDS与重症肺炎的BALF IL-8在早期均升高，但两者无明显差异，在

    晚期，重症肺炎的BALF IL-8显著降低，而ARDS则仍然是升高的。

    2.IL-8在ARDS发病中的作用

    IL-8在ARDS发病中的作用与中性粒细胞在肺中的聚集和激活关系

    密切。

    (1)趋化、聚集中性粒细胞

    如前所述，IL-8为一重要的趋化因子，其主要靶细胞为中性粒细

    胞，其对中性粒细胞的作用强于C5a和LTB4，这是因为IL-8不被血清灭

    活，故在局部的作用时间持久。静脉注射IL-8可迅速增加循环血中的中

    性粒细胞数，中性粒细胞的最大游走率提高8倍，而聚集的中性粒细胞

    本身亦是IL-8的来源，如此可形成恶性循环。体外研究表明，IL-8可增

    加L-选择素、白细胞粘附分子-1(LAM-1)的表达，促进整合素介导的

    中性粒细胞与内皮细胞的粘附，还可通过刺激磷脂酰肌醇-4-激酶途径，导致快速、持久的中性粒细胞肌动蛋白聚合和微丝等细胞动力装置改

    变，从而有助于中性粒细胞跨内皮向肺内浸润，造成肺损伤。(2)激活中性粒细胞，导致急性肺损伤

    在体外，IL-8呈剂量依赖性地刺激中性粒细胞脱颗粒，引起呼吸爆

    发，产生活性氧，并能激活花生四烯酸-5-脂氧化酶，产生LTs，导致血

    管通透性增加，血浆及蛋白渗出。最近的实验显示，将兔IL-8注入兔关

    节腔可引起大量中性粒细胞的聚集，并有呈正比数量的弹性蛋白酶的释

    放和软骨破坏；而将IL-8注入预先耗竭中性粒细胞的兔关节腔，则不出

    现上述结果。表明IL-8可活化中性粒细胞，释放蛋白水解酶等炎症介

    质，参与急性肺损伤的发生。

    3.IL-8抗体在ARDS防治中的作用

    既然IL-8在ARDS的发病中有如此重要的作用，则可以认为，IL-8

    的抗体应可以有助于ARDS的防治。尽管这方面的研究较少，但已有实

    验显示，在以IgG免疫复合物诱发ARDS的小鼠模型中，应用IL-8单克隆

    抗体能显著抑制白细胞聚集、肺通透性改变和出血。此外，IL-8单抗还

    能降低肺缺血再灌注损伤时BALF中的中性粒细胞数，减少肺泡腔中的

    纤维蛋白渗出和肺泡结构破坏。因此，IL-8在ARDS中的防治可能有广

    阔的前景。

    4.IL-8与ARDS的预后

    IL-8不仅参与ARDS的发病，而且与ARDS的病情严重程度呈正相

    关。有资料表明，ARDS的BALF中的IL-8水平在发病后24h，存活组和

    死亡组无显著差异，而发病后4天，死亡组的BALF中的IL-8水平显著高

    于存活组(p<0.005)。另一项临床观察也显示，BALF IL-8水平在死

    亡组为10650±97pgmL，存活组为2049±60pgmL，前者显著高于后者

    (p<0.05)。因此根据这些结果，IL-8水平可以作为判断ARDS预后的

    一个良好指标。第7章 细胞因子与心血管疾病

    一、细胞因子与冠心病

    动脉粥样硬化和血栓形成是冠心病的病理基础，动脉粥样硬化的形

    成过程对血管内膜的损伤而言，既是免疫反应又是炎性反应过程。在这

    个过程中，粥样斑块内的细胞可合成多种细胞因子，组成复杂的细胞因

    子网络。该网络的效应影响着细胞因子基因的表达和血管细胞的生长，从而对冠心病的发展起重要作用。

    1.肿瘤坏死因子(TNF)与冠心病

    (1)对血管内皮细胞和血栓形成的作用

    NF对血管内皮细胞的作用表现在两个方面：一方面是对血管内皮

    的直接损伤。TNF可诱导血管内皮细胞产生血小板活化因子(pAF)，后者通过活化血小板，使其发生粘附聚集和释放反应，引起血管通透性

    增加；pAF还可与嗜酸性粒细胞表面受体结合，激活G蛋白，使蛋白激

    酶C(pKC)及钙调蛋白(CaM)活化，作用于微管系统致细胞脱颗

    粒，释放强碱性蛋白和活性氧，同时加速脂质过氧化作用，损伤血管内

    皮细胞。TNF可使培养的血管内皮细胞发生形态改变，如细胞重叠、FN

    丢失，使血管内皮细胞通透性增高，以致血液胆固醇易穿透血管内膜在

    内膜下沉淀而形成粥样斑块。另一方面是对血栓形成的作用。TNF能抑

    制血管内皮细胞合成血栓调节素，使凝血酶不能与血栓调节素结合而活

    性加强，同时TNF还抑制具有抗凝血酶作用的蛋白C活化，导致血栓形

    成。此外TNF通过与血管内皮细胞表面受体结合，使纤溶酶原激活抑制

    物(pAI)产生增多，后者与组织型纤溶酶原激活物(t-pA)结合并使

    之失活，从而导致纤溶抑制，促使血栓形成，引起心肌供血不足，以致

    发生心绞痛甚至心肌梗死。

    (2)对平滑肌细胞的作用

    TNF能刺激平滑肌细胞产生过多的诱导型NO合成酶(iNOS)，同

    时α-肌动蛋白合成减少，使血管平滑肌收缩减弱，并对平滑肌细胞产生

    毒性作用，损伤细胞；TNF还可促使平滑肌细胞向血管内皮下浸润、聚

    集和增生，使内膜增厚，从而促进粥样硬化的形成。此外TNF还可调控

    IFN-γ的合成和分泌，因此，与IFN-γ产生协同的致病作用。

    (3)TNF对泡沫细胞形成的影响

    泡沫细胞是由巨噬细胞摄取大量低密度脂蛋白(LDL)并使其在胞

    内溶酶的作用下溶解并释出胆固醇，以致胞内游离的胆固醇不断地增多

    堆积而形成。所以泡沫细胞是动脉粥样硬化时内膜下胆固醇的重要来源。

    TNF-α可抑制巨噬细胞表面一种清除剂受体的表达，该受体的功能

    是能摄入LDL，并且其表达不像其他组织细胞的LDL受体那样受胞内高

    浓度游离胆固醇的下调影响，即使胆固醇浓度很高，亦能不断摄入脂蛋

    白。因此，TNF-α可抑制巨噬细胞摄入LDL，控制胆固醇代谢，阻止巨

    噬细胞转变为泡沫细胞。

    2.γ-干扰素与冠心病

    (1)对内皮细胞及平滑肌细胞的作用

    γ-干扰素(IFN-γ)能抑制内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，10μgml

    的IFN-γ即可抑制鼠颈动脉平滑肌细胞和人动脉内皮细胞的生长。在冠

    状动脉进行带气囊心导管改形术的大鼠中，经重组IFN-γ处理后，可明

    显抑制术后冠状动脉的再狭窄。

    (2)对泡沫细胞形成的影响

    IFN-γ还可抑制巨噬细胞清除剂受体的表达，从而减少脂蛋白的摄

    入和游离胆固醇的堆积，阻止巨噬细胞转变为泡沫细胞。

    (3)对其他细胞的作用

    与对内皮细胞和平滑肌细胞的作用相反，IFN-γ能促进T细胞的浸

    润，引起内膜的损伤，如IFN-γ通过诱导内皮细胞膜上MhC-Ⅱ类抗原的

    表达，增强其抗原提呈作用，促进免疫反应。IFN-γ还能与TNF-α协同作

    用，促进iNOS的合成作用，产生NO和自由基，造成血管组织细胞损

    伤，促进内膜增生，从而导致管腔狭窄，心肌缺血。此外IFN-γ还可促

    进多种粘附分子，如内皮粘附分子-1(ELAM-1)、细胞间粘附分

    子-1(ICAM-1)等的表达，这些粘附分子可能参与动脉粥样硬化的免

    疫及炎症过程。

    由此看来IFN-γ在冠心病中的作用呈双向性，既有损害的一面也有

    保护的一面。其在活体中的具体作用还有待进一步研究。

    3.白介素-1与冠心病

    白介素-1(IL-1)与TNF的作用类似，能诱导血管内皮细胞单层重

    建，抑制内皮细胞产生血栓调节素，从而破坏凝血-抗凝血平衡，导致

    血管内凝血，内膜增厚，血流减慢。IL-1还可诱导内皮细胞表达ELAM-

    1和ICAM-1等粘附分子，促进白细胞粘附于血管内皮细胞表面，其粘附

    效应在IL-1处理后4～6h即达高峰，24h后下降。白细胞的粘附聚集可促

    进血管内膜增厚的发展和动脉粥样硬化的形成。

    血管平滑肌细胞在受适当刺激后可分泌大量IL-1，后者又可通过诱导平滑肌细胞合成血小板源性生长因子(pDGF)，促进平滑肌细胞增

    殖，并向内膜下浸润，导致血管内膜增厚，促进动脉粥样硬化的形成。

    4.白介素-8与冠心病

    对56例冠心病患者的IL-8水平测定发现，血清IL-8水平与患者心绞

    痛的程度呈相关性。正常健康对照血浆IL-8水平为<3.0～3.3pgmL，有

    胸痛的患者则较高(p<0.05)，有不稳定心绞痛和AMI患者又显著高于

    其他胸痛患者(p<0.05)。在症状发作后2h，IL-8水平明显升高达

    106pgmL，峰值出现于症状发作后3小时，同时有白细胞计数、肌酸磷

    酸激酶(CK)、CK-MB、AST和血清肌红蛋白升高。这些结果表明，IL-8作为一个强有力的趋化因子，可使中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎

    症细胞的聚集和激活，并释放许多活性物质，引起血管内皮细胞损伤，诱发血管内凝血，在冠心病的发生发展中起着重要作用，同时因冠脉的

    进一步缺血而诱发心绞痛。

    5.血小板源性生长因子与冠心病

    血小板源性生长因子(pDGF)存在于血小板α颗粒中，当血小板粘

    附于损伤组织，如暴露于凝血酶、胶原和二磷酸腺昔(ADp)时，pDGF被释放。pDGF不仅来源于血小板，增殖的平滑肌细胞亦可通

    过“自分泌”形式产生pDGF。pDGF具有促进血管平滑肌细胞增殖和迁移

    的作用，故在冠心病的发生和冠状动脉再狭窄形成中起着重要作用。

    (1)pDGF在血管平滑肌细胞收缩中的作用

    研究发现pDGF诱导大鼠主动脉条的收缩呈浓度依赖性，这一作用

    强于血管紧张素Ⅱ，可能为通过抑制内皮源性舒张因子的合成而实现

    的。pDGF引起血管收缩的机制是：pDGF与其受体结合，激活酪氨酸激

    酶，进而激活磷脂酶C(pLC)，后者水解二磷酸磷脂酞肌醇生成Ip3和

    甘油二脂(DG)，Ip3与内质网特异受体结合，促使Ca2+释放，使

    [Ca2+]i升高，DG和Ca2+使pKC激活，后者在Ca2+协助下具有维持和

    促进平滑肌收缩的作用。

    (2)pDGF在血管平滑肌细胞增殖中的作用

    pDGF能促进成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞的有丝分

    裂，尤其对平滑肌细胞的作用更明显，使细胞从Gl、G0的静止期进入

    到细胞增殖期。pDGF受体含有N-乙酰氨基葡萄糖残基，当与pDGF特异

    结合后可显著增加动脉平滑肌细胞摄入胺类物质，增加动脉平滑肌细胞

    的胞饮作用，这些代谢改变对诱导细胞分裂、促进细胞增殖都有重要作

    用。此外，上述提到的Ca2+与DG诱导的pKC的激活，pKC在Ca2+的存

    在下可诱导c-sis基因的表达，从而可促进动脉平滑肌细胞的增殖。(3)pDGF在冠脉再狭窄中的作用

    冠脉再狭窄的形成实际上为血管内膜在球囊扩张或激光成形术所致

    的损伤后的过度修复过程。在此过程中，血管平滑肌细胞的增殖、迁移

    起重要作用，其中pDGF对血管平滑肌细胞的增生、迁移又起着作用。

    从经气囊导管损伤的动脉内膜中分离的平滑肌细胞观察到，其增殖速度

    要比未受损伤的平滑肌细胞快得多，且其增殖不依赖于血清pDGF，但

    它们可合成和分泌大量pDGF样生长因子，其浓度比正常平滑肌细胞高

    10倍。机械损伤离体培养的血管平滑肌细胞可即刻释放pDGF等多种生

    长因子，对血管平滑肌细胞有分裂源性和趋化性。给损伤的鼠颈动脉注

    射重组的pDGF-BB，可刺激血管内层及中层平滑肌细胞增生，而对未损

    伤的动脉无此作用。应用pDGF-BBAB抗体则可显著降低上述作用。在

    冠脉再狭窄过程中，有多种生长因子参与作用，如表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、转移生长因子等。这些生长因子与pDGF是否具

    有协同作用尚待进一步研究。

    二、细胞因子与心力衰竭

    肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种具有多种生物学效应的细胞因

    子。体内的多种细胞，如单核巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤

    维细胞等均具有产生和释放TNF-α的能力，其中激活的巨噬细胞是TNF-

    α的主要来源。成熟的心肌细胞在某些应激状态下也能产生和释放TNR-

    α，并参与多种心脏病的发生。TNF-α在体内的作用十分广泛，一方面

    具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌及抗寄生虫的正面作用；另一方面，它又

    参与介导一些严重的病理生理过程，如脓毒性休克、恶液质状态等负面

    作用而造成机体损伤。TNF-α在充血性心力衰竭的发展中具有广泛的病

    理生理作用，与许多临床特征，如心功能不全、心肌肥厚及肺水肿等密

    切相关。TNF-α的许多作用是通过其细胞膜上的受体来介导的。TNF-α

    受体有两种：低亲和力的TNFR1TNFR55和高亲和力的TNFR2TNF

    R75。

    1.心力衰竭时肿瘤坏死因子-α及其受体的水平变化

    临床研究已证明晚期心力衰竭病人的血中TNF-α水平明显升高。对

    晚期缺血性心脏病和扩张型心肌病病人的心脏标本测定结果表明，循环

    性TNF-α水平较正常对照高出近10倍(p<0.001)，而两种心脏病间的

    TNF-α水平无明显差异。对可溶性TNFR1和TNFR2循环水平的测定显

    示，两种心脏病的两种TNF-α受体比正常高1.4～3倍(p<0.03)，而两

    种心脏病间的比较无明显差异。用ELISA测定心脏中TNFR蛋白水平，发现两种心脏病总TNFR(包括TNFR1和TNFR2)蛋白水平比正常低

    60%～70%，其中TNFR1和TNFR2表达分别下降55%和65%，两种心脏病间均无明显差异。这些结果提示，在心脏病中TNFR是自动调节的，而在衰竭心脏中是下调的。但衰竭心脏中TNF-α水平升高，提示进行性

    心力衰竭时心脏本身是TNF-α的靶器官，这将导致心脏进行性失代偿，最终发生心力衰竭。

    2.肿瘤坏死因子-α在心力衰竭中的作用

    (1)对心血管功能的影响

    直接注射TNF-α可产生低血压、代谢性酸中毒、血液浓缩及死亡，类似于败血症性休克的心脏和血液动力学反应，而注射TNF-α抗体则可

    减轻上述反应。在临床实验中可观察到，注射内毒素可导致TNF-α升

    高，并明显抑制左室射血功能，降低平均动脉压。TNF-α对体外幼稚心

    肌细胞作用72h，对其基础收缩功能无影响，但使正性肌力药物

    (isoproterenol)的作用被减弱。TNF-α的延迟效应在狗体内的实验显

    示，一次性给予TNF-α可导致24h内心肌收缩性异常。TNF-α的这种延迟

    负性肌力作用是由细胞内钙平衡改变介导的。实验证明TNF-α作用后细

    胞内钙的峰值降低40%，膜片钳研究表明这一作用并非由电压依赖性钙

    通道改变所致，可能是TNF-α造成肌浆网释放Ca2+能力下降。

    (2)TNF-α负性肌力作用的信号通路

    TNF-α负性肌力作用的详尽的信号路径尚不清楚，但已有许多证据

    表明，TNF-α的延迟负性肌力作用是通过iNOS的表达和NO的产生而介

    导的，其介导机制如下：①NO刺激鸟昔酸环化酶，从而阻断成熟心肌

    细胞的钙离子流；②NO造成β-肾上腺素能刺激的cAMp生成缺乏，研究

    表明TNF-α刺激可导致心肌细胞中介导β-肾上腺素能信号的G蛋白的缺

    失；③TNF-α刺激心肌细胞72h可导致α1肾上腺素能受体诱导钙激活的

    第二信使Ip3降低所致。

    (3)TNF-α对心肌代谢和结构的影响

    TNF-α可以增加小鼠、大鼠及豚鼠心脏中脂蛋白脂肪酶活性，这可

    导致甘油三脂衍生的游离脂肪酸产生及利用增多，因而增加心肌的耗氧

    并对衰竭的心脏产生损害效应。将游离脂肪酸灌注缺血的狗心脏，可以

    产生明显的左心功能损害，并伴有左室扩大。灌注TNF-α可产生明显的

    左室扩大，表现为左室舒张压力-容积曲线右移，左室舒张末压力-应变

    (strain)曲线左移，导致左室容积增加，顺应性严重受损。

    第四节防治细胞因子相关疾病的措施

    目前，防治细胞因子相关疾病的措施主要有细胞因子疗法

    (cytokine therapy)，其基本上可分为两种，即细胞因子补充和添加疗法及细胞因子阻断和拮抗疗法。

    1.细胞因子补充和添加疗法

    通过各种途径使患者体内细胞因子水平增加，充分发挥细胞因子的

    生物学作用，从而抗御和治疗疾病。目前已有多种细胞因子(多为基因

    重组产品)试用于临床治疗。经大量临床资料验证，以下几种细胞因子

    的临床适应症比较明确，临床疗效比较肯定。

    (1)IFN

    不同型别的IFN各有其独特的性质和生物学活性，其临床应用适应

    症和疗效有所不同。IFN-α主要用于治疗病毒性感染和肿瘤。IFN-α对于

    病毒性肝炎(主要是慢性活动性肝炎)、疱疹性角膜炎、带状疱疹、慢

    性宫颈炎等有较好疗效。IFN-α对于血液系统恶性疾病如毛细胞白血病

    (有效率达80%以上)等疗效较显著，但对实体肿瘤的疗效较差。虽然

    IFN-γ的免疫调节作用强于IFN-α，但其治疗肿瘤的效果弱于IFN-α，目

    前有人应用IFN-γ治疗类风湿关节炎、慢性肉芽肿取得了一定疗效。

    (2)IL-2

    目前多将IL-2与LADTIL合用治疗实体肿瘤，对肾细胞癌、黑色素

    瘤、非何杰金淋巴瘤、结肠直肠癌有较显著的疗效，应用IL-2(或与

    IFN合用)治疗感染疾病亦取得了一定疗效。

    (3)TNF

    由于其全身应用副作用严重且疗效差，目前多倾向将其局部应用如

    瘤灶内注射治疗某些肿瘤和直肠癌，其确切疗效尚待进一步评价。

    (4)CSF

    目前主要应用GM-CSF和G-CSF治疗各种粒细胞低下患者。例如与

    化疗药物合用治疗肿瘤可以降低化疗后粒细胞减少程度，使粒细胞的数

    量和功能能尽快回升并能提高机体对化疗药物的耐受剂量，从而提高治

    疗肿瘤的效果。对再生障碍性贫血和AIDS亦有肯定疗效。用于骨髓移

    植后可使中性粒细胞尽快恢复，降低感染率。此外，应用EpO治疗肾性

    贫血取得了非常显著的疗效。

    2.细胞因子阻断和拮抗疗法

    该疗法的基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与其相应

    受体的结合及受体后信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发

    挥。该疗法适用于自身免疫性病、移植排序反应、感染性休克等的治

    疗。例如抗TNF单克隆抗体可以减轻甚至阻断感染性休克的发生，IL-1

    受体拮抗剂对于炎症、自身免疫性疾病等具有较好的治疗效果。第8章 自由基概述

    一、自由基的基本概念

    自由基(FR)是指独立存在的含有一个或一个以上未配对电子

    (即原子轨道中具有奇数电子)的任何离子、原子、原子团或分子。书

    写时以一圆点表示未配对的电子(unpaired elctron)，例如氯自由基

    (Cl·)、羟自由基(Oh·)、甲基自由基(Ch3·)等。有些分子如一氧

    化氮(NO)和氧气(O2)等形式虽无圆点表示，但因其分子中存在奇

    数电子，也是自由基。自由基生物学在其发展初期，研究的内容基本上

    是活性氧的产生和清除、危害与利用。1986年，一氧化氮的生物学效应

    被发现后，自由基生物学的主要内容除活性氧外，尚包括以一氧化氮为

    主的活性氮。

    因此，对生物自由基的研究主要集中于活性氧(reactive oxygen

    species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)两大类。

    二、自由基的产生、特点及其影响因素

    1.自由基的产生

    (1)共价键均裂

    自由基可以是某些原因使具有共价键的化合物分子(R∶X或R-X：

    表示由两个电子构成的共价键，-表示共价键)发生均裂而形成的产

    物。均裂(homolyticbond cleavage)指共价键断裂后，共用的电子对一

    分为二，分别属于两个原子或原子团，生成了含有奇数电子的自由基，即R：X→R·+X·；如水在电离辐射下分解，产生氢自由基(h·)及羟自

    由基(Oh·)，即hO：h→h·+Oh·。

    自由基具有独立未配对的电子，由共价键发生均裂产生，而均裂是

    需要能量的，因此能提供能量的因素(热能、电离辐射等)可促进共价

    键的均裂而导致自由基的产生。

    (2)电子转移法

    带有成对电子或者在两条平行轨道上各带有一个不成对电子的分子

    在反应中取得一个电子或失去一个电子，就可以成为带有一个不成对电

    子的自由基，这种产生自由基的方法就是电子转移法。如电子俘获就是

    其中之一，即不通过金属离子的氧化还原反应，从其他来源俘获一个电

    子，从而使非自由基成为自由基，如CCl4俘获一个电子，可产生·CCl3

    与C1-。

    2.自由基的特点(1)绝大多数自由基活性强，极不稳定。

    (2)自由基存在的时间极短，有的为毫秒(ms)(如O·)，有的

    不超过纳秒(ns)(如Ch3·)。

    (3)自由基在生物体内的浓度极低(10-9~10-4molL)，较难测

    定，其未配对的电子形成一个弱磁场，具有顺磁性，因而能用电子自旋

    共振光谱法(电子顺磁共振波谱仪)来检测，也可采用其他的物理和化

    学测定法。

    (4)在自由基反应中，有自由基-自由基反应、氢抽提反应、加成

    反应等。其中的链式反应最显示典型自由基反应的特色。这种连锁反应

    与离子反应不同，一经启动就连锁进行。一般可分为引发、增殖、终止

    三个阶段。伴随这一链式反应过程，可有大量的自由基中间产物生成。

    3.自由基产生的影响因素

    (1)具有弱键的分子如组成生物膜的磷脂分子，含有不饱和的脂

    肪酸双键，属于弱键(键的能量较低)，容易发生均裂，产生自由基或

    受自由基的影响。

    (2)电离辐射。

    (3)光分解。

    (4)单电子氧化还原作用。

    (5)热解。

    (6)其他：空气中的具有较强氧化性的物质，如O2、NO、NO2等

    能启动自由基反应；体内某些酶促氧化还原反应，如在黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、二氢乳清酸脱氢酶等所催化的需氧脱氢酶反应中，往往会产

    生自由基中间产物。

    三、生物体内几种常见活性氧及活性氮

    1.生物体内常见活性氧

    生物体内产生的活性氧主要包括超氧化物阴离子自由基(O·-2)、羟自由基(Oh·)及其衍生物如过氧化氢(h2O2)、单线态氧(1O2)

    及LO·、LOO·和LOOh等脂质过氧化物。

    (1)超氧化物阴离子自由基(O·-2)

    1)超氧化物阴离子自由基的产生：O·-2的产生部位为细胞的线粒

    体、微粒体、浆膜和细胞质等，通过酶系统和非酶系统反应而产生。

    酶促氧化还原反应，如黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、NADh氧化酶、过氧化物酶等均可促使O·-2生成。如黄嘌呤氧化酶(XO)催化黄嘌呤

    转变为尿酸的两步反应中，可产生大量的O·-2和h2O2。

    非酶促的氧化还原反应，如氢醌、核黄素(维生素B2)、儿茶酚

    胺、亚铁血红素、铁硫蛋白、谷胱甘肽及过渡金属离子等自动氧化作用

    均可产生一定量的O·-2。

    2)超氧化物阴离子自由基的毒性：O·-2不仅本身是性质活泼的自

    由基，而且也是导致自由基连锁反应的始动环节，可形成活性更强、对

    细胞毒性更大的羟自由基。因此O·的毒性，除了其本身引起氧化或还原

    反应等所致的损伤外，更重要的是O·-2和h2O2相互作用后的中间产物羟

    自由基及有机过氧化所引起的细胞毒性。

    3)超氧化物阴离子自由基的清除：超氧化物歧化酶(superoxidc

    dismutase，SOD)是清除O·-2的抗氧化酶。SOD存在于所有有氧代谢的

    细胞内，是机体免受自由基损伤的主要防御酶，对维持体内氧化与抗氧

    化系统的平衡具有重要作用。O·-2最重要的化学反应是通过歧化而生成

    过氧化氢，Mn为SOD活性部位的金属离子之一，在易得失电子的金属

    离子(如Mn、Cu、Zn等)催化下，可加速歧化反应速度。这种由过渡

    金属离子催化的歧化反应，称为Fenton反应。O·-2虽可自然歧化，但因

    O·-2阴离子而互相排斥，故反应速度缓慢。如有SOD存在，其歧化反应

    速度则可增加109倍。此外，细胞色素C(Cyt C)、抗坏血酸

    (VitC)、维生素E(VitE)和含巯基(-Sh)的化合物等均可通过氧化

    还原反应清除O·-2。

    (2)羟自由基(Oh·)

    1)羟自由基的产生：由O·-2的歧化反应和电离辐射的作用而产

    生。

    2)羟自由基的毒性：Oh·是毒性最强、性质最活泼的自由基，可作

    用于脂质、蛋白质、核酸等有机大分子。它是脂质过氧化作用的主要引

    发剂，通过从膜磷脂的多不饱和脂肪酸上抽提氢，而引发膜脂质过氧化

    作用的链式反应，导致膜系统的严重损伤；或通过加成反应与DNA或

    RNA上的嘌呤和嘧啶碱(双键)相互作用，引起RNA和DNA分子内

    部、分子之间的交联，影响DNA和RNA功能。细胞膜脂质过氧化作用

    除了导致膜功能的障碍和膜酶的损伤外，脂质过氧化反应过程所产生的

    活性氧对细胞内的酶和其他细胞成分也造成损伤。脂质过氧化物的分解

    代谢产物特别是丙二醛(malondialdehyde，MDA)，其生成量的多少

    反映了过氧化的程度且对细胞及其成分有毒性效应。

    3)羟自由基的清除：目前尚未发现机体内有特异性的酶可清除Oh·，但Oh·可被甘露醇、二甲基亚砜(DMSO)、苯甲酸盐、色氨酸及

    水溶性小分子抗氧化剂如抗坏血酸和谷胱甘肽等清除。

    (3)过氧化氢(h2O2)

    1)过氧化氢的产生：如前所述，生物体内O·都能通过歧化反应生

    成h2O2，即经单价还原或自动氧化而产生。或者通过酶促反应生成，如氧分子在尿酸盐氧化酶、D-氨基酸氧化酶、葡糖氧化酶及黄嘌呤氧化

    酶等参与下，双电子还原生成h2O2。

    2)过氧化氢的清除：还原型谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione

    peroxidase，GSh-pX)和过氧化氢酶(catalase，CAT)可有效清除

    h2O2，以防止h2O2的破坏作用。此外，GSh-pX和CAT也是清除活性氧

    的重要酶。GSh-pX可分为为含硒GSh-pX (Se-GSh-pX)和不含硒GSh-

    pX(non-Se-GSh-pX)两种，后者又称为谷胱甘肽硫转移酶

    (glutathione-S-transferase)，GSh-pX一般指SeGSh-pX，它是哺乳动物

    中目前所知唯一含硒的酶，属于氧化还原酶类，主要分布在胞质及线粒

    体内。CAT主要分布在过氧化物酶体内。两者协同作用催化分解体内

    h2O2等，防止染色体的损伤和基因突变。但是，CAT只在h2O2浓度较

    高时才起作用，故认为，一般情况下，GSh-pX在对抗h2O2等多种氧化

    作用损伤，维持自由基代谢平衡上比CAT更为重要。

    (4)单线态氧(1O2)

    1)单线态氧的产生：分子氧的电子自旋多重性为三，故又称三线

    态或三重基态(triplet ground state)氧(3O2)。3O2的外层轨道中有2

    个同向自旋的电子，当3O2接受了能量而被激活时，其中一个电子被激

    发而改变自旋方向，2个电子自旋方向相反，这时的电子自旋性为一，称为单线态氧(1O2)。目前已知1O2可以在某些自由基反应中形成，又能触发其他的自由基反应，但其生成的途径还不太清楚。有人认为在

    Oh·生成过程中，也可产生1O2；O·-2和h2O2自然歧化过程可生成1O2；

    O·-2与Oh·作用也可生成1O2；此外，光敏反应，如光敏剂(水溶性核黄

    素、胆红素和视黄醛等)在一定光线的照射下，吸收能量至“激发态”，激发的能量可以传递给氧分子，使其成为1O2；某些酶促歧化反应如细

    胞色素p450可作用于R基过氧化物(-ROOh，烷或脂自由基)而产生

    1O2。

    2)单线态氧的毒性：1O2的毒性除了引发脂质过氧化作用外，还

    在于它触发的其他自由基反应的损伤作用。

    3)单线态氧的清除：1O2的清除剂包括α生育酚、抗坏血酸、谷胱

    甘肽、胆红素、β胡萝卜素、胆固醇、色氨酸、半胱氨酸和超氧化物阴离子自由基等。1O2清除有两种方式：一是与其他分子化学结合生成过

    氧化物等；二是将激发能传递给其他分子，使其他分子处于激发动态而

    本身回到基态，这种现象称为淬灭。

    2.生物体内常见活性氮

    活性氮以NO分子为主。1935年，Davy在研究N2O的过程中发现了

    NO之后，相当长的一段时间内，从未有人想过把这个结构简单、毒性

    又高的小分子化合物和机体的生理功能相联系。直到1987年palmer和

    Feridge等在Nature杂志上首次提出，通常所说的血管内皮衍生舒张因子

    (endothelium derived relaxing factor，EDRF)其实就是NO。气体分子

    作为生物活性物质的发现，引起了科学界的震动，也掀起了世界各国科

    学家对NO的研究热潮，有关NO的相关研究报告大量涌现，这些研究资

    料既充实了自由基生物学及医学的某些空白领域，也极大地促进了相关

    学科的发展。1992年，美国Science杂志上将NO评为当年“明星分子”。

    除了NO，活性氮还包括NO合成和代谢过程中生成的含氮自由基，如NO与O2反应生成的ONOO·；NO与O·结合生成的ONOO及其质子化

    产物ONOOh，后者还可转变为ONOOh·。这些衍生物化学活性都很高，且部分化学性质类似氧自由基，因此在广义上也属于活性氧。

    (1)一氧化氮的产生

    机体内NO生物合成的唯一途径是一氧化氮合酶(nitric oxide

    synthase，NOS)的酶促反应。底物为L-精氨酸，需要NADph与O2参

    与，辅助因子为FAD、FMN、四氢蝶呤与原卟啉Ⅸ血红素，在NADph

    与O2参加和辅助因子存在下，NOS可使L-精氨酸在酶促反应中转变为中

    间产物，即Nw-羟基-L-精氨酸(NhA)，然后产生NO及瓜氨酸，同时

    NADph转变为NADp+，O2转变为h2O。

    目前研究发现NOS有三种亚型：神经元型NOS(nNOS)、内皮型

    NOS(eNOS)及诱生型NOS(iNOS)。前两种又合称为内生型

    NOS(cNOS)，为Ca2+钙调蛋白依赖型，在正常生理情况下就处于转

    录、翻译和催化NO合成状态，但产生NO的量少，且NO主要是维持一

    些正常的生理功能，如维持血管的舒张和神经信息的传递等。诱生型

    NOS(iNOS)为非Ca2+依赖型，可诱导生成大量NO，它广泛存在于巨

    噬细胞、中性粒细胞、肝细胞中。

    (2)一氧化氮及其衍生物的毒性

    NO是一种活性很强的自由基，具有氧化还原特性。研究证实，一

    方面，NO不仅有内皮舒张作用，还具有其他多种生理功能，如作为神

    经传导的逆信使，杀伤肿瘤细胞与入侵微生物、生理调节等；另一方面，它还具有一些病理生理学作用，如亚硝酰化、硝基化、DNA脱氨、氧化损伤、神经损伤等。

    NO与O2一起可构成氧化还原对，它们相互作用可形成活性更强的

    化学物质，如NO与O2反应生成的ONOO·；NO与O·结合生成的ONOO

    及其质子化产物ONOOh，它们攻击生物靶分子，使谷胱甘肽与抗坏血

    酸等丧失抗氧化剂作用，并可使硫醇类化合物成为S-亚硝酰硫醇、胺类

    成为亚硝酰胺类等，比NO本身可能具有更大的潜在毒性。

    因此，自由基除O2等活性氧外，NO也是一种气体自由基，半衰期

    极短，可以和机体内许多物质发生反应，作为一种脂溶性小分子，可自

    由弥散出入于细胞膜内外。这些特点使NO成为一种作用更广泛、需时

    更短的信使分子。如NO可与铁原子发生作用，很多蛋白均含有铁，如

    血红蛋白、可溶性鸟苷酸环化酶及铁硫蛋白的复合物等，NO与铁作用

    后可引起这些含铁的酶的激活增加或失活；NO还可与酶活性中心的巯

    基反应(如GSh-pX)而改变酶活性；NO可影响细胞内激酶，进而影响

    细胞内的信息传递，严重时导致疾病。因此，正常时低水平的NO作为

    生理的细胞内信使传导，对机体是有益的。反之如浓度过高或过低，均

    可引起机体损伤。

    如前所述，机体通过酶系统或非酶系统反应等不断地产生自由基，尤其是氧自由基(oxygen-derived free radicals，OFR)，同时，机体为

    防止氧及其代谢产物对机体的毒性作用，在进化中逐渐完善了适应环境

    的种种保护措施，形成两个完整的抗氧化防御系统。这个系统包括抗氧

    化酶(SOD、GSh-pX、CAT等)和抗氧化剂(脂溶性抗氧化剂和水溶

    性小分子抗氧化剂)，从预防、阻断和修复三个水平发挥防御作用，不

    断地清除自由基，使体内自由基含量很微，并处于动态平衡。体内存在

    的少量自由基参与许多重要的生理生化反应，如O·与ATp生成有关、Oh·与前列腺素的合成有关、中性粒细胞和吞噬细胞呼吸爆发

    (respiration burst)时产生的O·和h2O2等与机体的防御功能有关；O·还

    可作为基质或中间体(inter-mediate)参与体内对药物或毒物羟化反应

    等解毒过程等；NO则与松弛血管平滑肌、防止血小板凝聚、神经传导

    及光感受器的信号发射等生理功能有关。而作为自由基，无论是活性氧

    还是活性氮，都具有细胞毒性因子作用。因此，自由基对生物机体的作

    用应从两方面来看：一方面，适量的自由基是机体某些物质的生物合成

    所不可缺少的，并且机体防御体系、体内的解毒、正常生理功能调节等

    均需自由基的参加；对机体来说，体内的新陈代谢和一些生命现象与自

    由基之间存在着各种各样的联系；另一方面，当某些因素打破了体内自

    由基生成和消除的动态平衡时，就会使自由基超过生理限度，导致蛋白质、酶等生物大分子的损伤等，并可能由于这些损伤作用而产生各种病

    变，进而引起疾病或者加速机体的衰老等。第9章 自由基与疾病

    体内自由基生成和消除的动态平衡对机体是有利的。但是，当由于

    某些原因使自由基在体内生成过多或(和)清除不足时，自由基水平急

    剧升高，则会引起生物大分子的损伤、酶失活，进而引起细胞功能障

    碍，导致多种疾病产生和加速机体衰老进程等。如果自由基的种类主要

    是氧自由基的话，通常称为氧化应激(oxidative stress)。

    一、自由基与生物膜与生物大分子

    在氧存在的情况下，自由基可以引发细胞内外的多种生化成分的氧

    化反应。

    1.自由基与生物膜

    生物膜主要成分是脂质、蛋白质和糖类。脂质以磷脂为主，而磷脂

    则多由多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，pUFA)组成。

    pUFA有多个弱键和不饱和键，自由基对其有很高的亲合力，因此，生

    物膜易受自由基攻击而发生过氧化连锁反应，从而造成生物膜的脂质过

    氧化损伤。

    氧自由基作为机体内的主要自由基，可引起细胞膜、线粒体膜、微

    粒体膜和溶酶体膜发生脂质过氧化，产生脂质过氧化物(lipid

    peroxidation，LpO)。LpO及其降解产物(醛类及烃类)可加重生物膜

    的损伤：(1)破坏膜的稳定性和完整性，导致膜的液态性、流动性降

    低，通透性增加，最终导致细胞的坏死；(2)脂质过氧化使膜脂质之

    间形成交联和聚合，这可间接抑制膜蛋白如钙泵、钠泵及Na+Ca2+交换

    系统等的功能，导致胞浆Na+、Ca2+浓度升高，造成细胞肿胀和钙超

    载，膜液态性降低和膜成分改变还可影响信号转导分子在膜内的移动，抑制受体、G蛋白与效应器的偶联，造成细胞信号转导功能障碍；

    (3)膜脂质过氧化可激活磷脂酶C、磷脂酶D，进一步分解膜磷脂，催

    化花生四烯酸代谢反应，在增加自由基生成和脂质过氧化的同时，形成

    多种生物活性物质，如前列腺素、血栓素、白三烯等；(4)线粒体膜

    脂质过氧化，导致线粒体功能抑制，ATp生成减少，细胞能量代谢障碍

    加重。此外，自由基可作用于细胞膜上的寡糖链中糖分子的羟基碳使之

    氧化成为不饱和碳基或二聚体引起细胞的多糖链破坏造成细胞自溶。如

    红细胞膜发生脂质过氧化损伤后，通透性增加，细胞变脆，易发生溶

    血。

    2.自由基与生物大分子

    (1)蛋白质与酶自由基可使氨基酸残基氧化，胞浆及膜蛋白和某些酶交联形成二聚

    体或更大的聚合物，直接损伤蛋白质和酶的功能。膜离子通道蛋白的抑

    制与膜磷脂微环境的改变一起，共同导致跨膜离子梯度异常。自由基可

    使酶的巯基氧化，形成二硫键，导致酶的活性异常。

    (2)遗传物质

    自由基可使碱基羟化或DNA断裂，从而引起染色体畸变或细胞死

    亡。这种作用的80%为Oh·所致，因Oh·易与脱氧核糖核酸及碱基发生反

    应并使其结构改变。Oh·能与DNA 碱基发生反应而损伤碱基，主要表现

    为氢抽提、电子转移和加成。抽氢反应发生在胸腺嘧啶的甲基基团和脱

    氧核糖的C 原子上，5个C 原子发生抽氢反应的几率一致。此外，Oh·能

    与碱基发生电子转移，Oh·转变为Oh·，而碱基则变为相应的碱基自由

    基，从而损伤碱基。Oh·能与DNA 碱基杂环的双键加成，在嘧啶碱基的

    C5和C6位，分别生成C5·Oh和C6·Oh加合物自由基；也有学者认为，Oh·攻击嘌呤碱基时，加成反应发生在C4、C5及C8位上。此外，DNA

    链的断裂也是DNA损伤的表现之一，主要是在Oh·攻击下脱氧核糖遭破

    坏，磷酸二酯键发生断裂或碱基遭破坏或脱落。此外，电离辐射通过对

    生物大分子的直接和间接作用导致DNA损伤。辐射离子在体内产生次级

    高能离子和自由基(如Oh·)，其作用于DNA，从而引起DNA链的断

    裂。

    自由基不仅损伤细胞核内的DNA，与线粒体DNA(mtDNA)的损

    伤也有关，mtDNA在位置上非常接近线粒体ROS产生部位，有研究表明

    机体内的自由基水平与mtDNA的8-羟基鸟嘌呤水平密切相关。

    (3)多糖

    细胞膜的表面镶嵌着各种功能蛋白质，包括离子通道、受体、酶

    等，有的蛋白质和脂质表面还连接着一些具有抗原性的多糖分子，这些

    多糖分子在细胞相互识别、辨别非己成分方面有着重要的功能。但由于

    多糖分子多是天然的还原剂，在自由基的氧化作用下，多糖分子易发生

    氧化还原反应，导致多糖分子间的键氧化和断裂，使细胞膜的流动性和

    抗原识别能力等受到严重的影响。

    二、自由基与心血管系统

    1.心肌的缺血-再灌注损伤

    1960年Jennins等首先提出心肌缺血-再灌注损伤的概念，证实缺血-

    再灌注会引起心肌超微结构不可逆坏死，即缺血的心肌恢复再灌注后，病情没有好转反而恶化，引起心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面

    发生进一步损伤，称为缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury)。

    近年来，随着溶栓疗法、动脉搭桥术、经皮腔内冠脉血管成形术

    (percutaneous transluminal coronary angioplasty，pTCA)、心脏外科体

    外循环等方法的建立和推广，使缺血器官、组织重新获得血液供应，明

    显减轻了细胞损伤，提高了临床疗效，但由于缺血-再灌注损伤的存在

    对患者的预后有着重要的影响。

    目前认为，缺血-再灌注损伤发生的主要机制与自由基损伤、钙超

    载、白细胞的激活和微血管损伤等有关。心肌缺血-再灌注损伤会产生

    大量的自由基，自由基可导致细胞内DNA、RNA、蛋白质及多糖分子

    氧化、交联、变性和降解，其最重要的过程是自由基作用于细胞膜上的

    不饱和脂肪酸等脂质过氧化表现为：改变膜结合酶、受体、离子通道和

    膜微环境，使膜蛋白质功能异常；形成异常的离子通道，对Ca2+有特殊

    的通透性，引起心肌胞浆的Ca2+过负荷，进而使钙盐在线粒体中聚集，抑制心肌能量生成；促使膜上的蛋白质和磷脂交联，引起蛋白质不可逆

    损伤，致其活性降低或失活；膜结合酶活性中心上的巯基被氧化，致酶

    活性丧失；脂质过氧化的激活、磷脂酶的活化、溶血磷脂和游离脂肪酸

    的洗涤作用是级联损伤，是缺血心肌从可逆损伤发展为不可逆损伤的基

    础：脂质过氧化过程的激活，可使含有大量磷脂酶的溶酶体活化，其释

    放出的磷脂酶和被激活的膜结合磷脂酶能破坏磷脂双层膜，产生溶血磷

    脂和游离脂肪酸，溶血磷脂和游离脂肪酸通过洗涤作用又能诱导脂质过

    氧化的激活。这一系列的连锁反应，引起心肌细胞膜对Ca2+的通透性增

    加，而[Ca2+]i增加再激活磷脂酶和脂质过氧化反应，这种恶性循环

    的如果持续进行，最终会导致心肌细胞从可逆性损伤发展到不可逆性损

    伤，直至心肌细胞凋亡和死亡。

    因此，在心肌的缺血-再灌注过程中，大量自由基的产生并导致的

    心肌细胞损伤是不可忽视的重要因素。

    2.动脉粥样硬化

    近年来，自由基在冠状动脉粥样硬化发病中的作用受到越来越多学

    者的关注。自由基可通过氧化作用，诱导血管基因表达，促进局部炎性

    反应和细胞增殖，多方面参与动脉粥样硬化的发生发展过程。

    外源性或内源性的氧自由基可氧化修饰低密度脂蛋白(low density

    lipoprotein，LDL)产生氧化低密度脂蛋白(oxidized low density

    lipoprotein，ox-LDL)和丙二醛-低密度脂蛋白(MDA-LDL)，引起内

    皮细胞的损伤和功能障碍。ox-LDL等可以通过刺激细胞间粘附分子1、血管细胞粘附分子1、p2选择素、E2选择素等的表达，使单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞粘附于内皮细胞，并诱导单核细胞、T淋巴细胞进

    入内皮层，导致局部血管炎性反应加重，内皮细胞膜通透性增加，前列

    环素(prostaglandin，pGI2)合成减少，多形核细胞

    (polymorphonuclear cell，pMN)呼吸爆发、血小板聚集、O·释放增

    加，内皮损伤进一步加重。此外，Ox-LDL可被单核巨噬细胞膜上的清

    道夫受体、CD36受体和Fc受体识别后大量无限制摄入，形成泡沫细

    胞，促进内皮细胞纤维斑块的形成。

    自由基还可刺激血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)内神经鞘磷酯酶活性、促进血管平滑肌细胞释放成纤维细胞生

    长因子，诱导平滑肌细胞和巨噬细胞增殖。另外，ROS可直接损伤血管

    内皮，并刺激血管平滑肌细胞增殖与肥大，使血管重构，还可激活基质

    的金属蛋白酶和基质降解酶，促进细胞外基质和胶原降解，甚至导致斑

    块破裂而促发不稳定心绞痛。

    3.高血压

    目前认为高血压病是一种多基因遗传病，即在一定遗传背景下，由

    后天多种因素共同作用所引起血压调节异常。同时，越来越多的证据表

    明自由基亦参与高血压病的发生发展。如有高血压家族史的正常志愿

    者，其体内OFR的产生较无高血压家族史明显增多，且OFR的升高先于

    血压升高，并在高血压靶器官的损害进程中起重要作用。

    自由基对血管紧张度有直接的调节作用，氧化应激介导的血管内皮

    功能受损引起舒血管活性物质释放减少，导致血管调节异常，O·-2可与

    NO反应而生成ONOO·，血管内皮NO量减少，引起O·-2与NO间的平衡

    失衡，对维持正常血压有不利影响。但自由基对血压的调节作用与其作

    用的ROS的种类和浓度及其存在的部位、具体作用的血管、血管内皮完

    整性等相关。如有研究表明O·-2、h2O2可引起血管收缩，而整条动脉或

    VSMC加入外源性h2O2则引起舒张。

    有研究表明，ROS或细胞内巯基轻微的氧化便可以强烈地激活丝裂

    原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MApKs)，抑制酪氨酸

    磷酸酶活性，导致转录因子(NF-κB，Ap-1等)激活，通过调节基因表

    达，诱导VSMC增生肥大，促进高血压的血管重构进程。有学者观察到

    静脉注射SOD和一种肽(C端能定位于内皮细胞)的融合蛋白可使自发

    性高血压大鼠的血压下降，而对照组血压不降，表明氧化应激与高血压

    发病有关。另有研究发现，AngII所致高血压病的部分机制与自由基有

    关。NADph 氧化酶可产生OFR，且OFR与NO迅速反应可生成更强的

    OONO·，最终导致内皮依赖的舒血管作用消失，而给予外源性SOD可

    使AngII高血压大鼠的血压恢复正常。同样，若使用AngⅡ转换酶抑制剂和AT1受体拮抗剂也可通过抑制AngII对NADph氧化酶的作用，则可以

    减少OFR的生成。

    4.病毒性心肌炎

    病毒性心肌炎的发病机制迄今仍不完全清楚。近年来证实氧自由基

    参与了病毒性心肌炎的发病过程。有临床资料表明患者血中红细胞SOD

    活性普遍降低，血清LpO和红细胞过氧化氢溶血率明显高于正常人，提

    示其发病的与SOD活性降低和O·堆积有关；同时，在炎症过程中，中性

    粒细胞释放1O2、h2O2、溶菌酶等使OFR生成增加；这些患者经抗氧化

    剂治疗后，病情随之好转，红细胞内SOD活性恢复正常。但在急性炎症

    期和危重患者血清LpO中浓度明显增高。因此，在病毒性心肌炎的发病

    和治疗中的自由基因素值得关注。

    5.心律失常

    新近研究表明自由基(O·、Oh·)在心律失常发病中发挥重要作

    用。pallamdi等报道OFR损伤心肌细胞膜，导致膜完整性和通透性改

    变，以及膜通道离子泵的功能改变，可诱发心律失常的产生，其机制可

    能与下列因素有关：①心肌细胞膜缓慢可逆性的去极化，导致1期去极

    化最大速率下降和振幅降低，心肌传导性降低，有利于折返的形成；②

    阈电位接近于膜电位，心肌细胞兴奋性增高；③钠通道内向电流增加，导致单个或一组细胞的潜在自动去极化倾向、细胞自律性加强等。尽管

    有很多机制尚不清楚，但自由基在心律失常发生中的作用值得深入进一

    步探讨。

    三、自由基与脑

    脑组织氧耗量约占机体总氧耗量的20%，生理状态下即产生大量

    ROS，因而神经元较其他组织细胞处于更高的ROS环境中。

    1.阿尔茨海默病(Alzhemier's disease，AD)

    AD是一种神经退行性疾病，以痴呆、认知功能障碍、记忆丧失为

    特征。目前，AD的世界患病人数超过3500万，中国患病人数已超500

    万。年龄是AD的主要危险因素，65岁以上人群年龄每增加5岁AD患病

    率将增加2倍。随着我国人口老龄化进程逐步加快，AD患病人数将更加

    庞大。

    AD脑组织的病理特征为老年斑形成、神经元纤维缠结、突触丧

    失，前两者分别包含大量聚集的β淀粉样肽(amyloid βpeptide，Aβ)和

    高磷酸化tau蛋白。AD发病机制存在多种学说，如Aβ沉积说、tau蛋白理

    论、炎性损伤说、金属离子中毒说等，其中由异常沉积Aβ诱导的氧化应激可产生的大量ROS，其可引起神经元代谢障碍和突触功能丧失，是

    AD发病过程中重要的环节。

    AD脑组织的抗氧化功能较正常弱，除代谢性ROS、Aβ诱导的氧化

    应激、线粒体功能异常之外，氧化型金属离子、星形细胞小胶质细

    胞、糖基化终产物等也是ROS的重要来源。ROS可造成生物活性分子如

    蛋白质、脂质、糖类、核酸等氧化修饰，使之丧失原有结构和功能；脑

    组织为拮抗自由基而代偿性加速Aβ斑块沉积，沉积的Aβ继续产生

    ROS，加剧恶性循环。此外，Aβ自身亦可介导膜脂质、脂蛋白、脂酸等

    过氧化，损伤DNA，灭活转运酶类等。慢性氧化应激还可诱导tau蛋白

    磷酸化，参与神经元损伤过程，促进AD进展。RNA较DNA易受氧化损

    伤，有研究证实RNA氧化损伤常在AD早期发生。

    ROS信号转入细胞核的过程中，激活的蛋白激酶(stress-activated

    protein kinase，SApK)通路发挥核心作用。c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-

    terminal kinases，JNK)SApK1和p38SApK 2是两种主要的SApKs，ROS及其效应物RNS可激活JNK和p38，调节caspase-3和p53引起蛋白水

    解和细胞凋亡。ROS还可直接氧化修饰p53，参与神经元变性过程。研

    究发现AD病程早期SApK的激活主要在核内，而晚期则主要在胞浆且与

    tau蛋白磷酸化及神经纤维缠结密切相关，这种从胞核至胞浆的分布过

    程表明，SApK通路在AD发生发展中起重要作用。另有研究表明，ROS

    可上调Aβ前体蛋白(Aβprecursor protein，App)也与SApK 通路相关；

    由于SApK激活早于Aβ沉积，据此推测，氧化应激并非首先通过Aβ再激

    活SApK，而是Aβ沉积后可产生ROS，ROS进一步激活SApK，结果在

    ROS、SApK、Aβ间形成恶性循环，但随Aβ升高并非所有神经元的

    SApK均激活，这表明还有其他分子参与其中。SApK激活还可能是神经

    元的代偿性抗氧化机制，它甚至可诱导抗氧化酶如SOD生成。总之，前

    述Aβ代偿性沉积和自由基的损伤可加重神经元和脑组织的损伤，于是

    AD病程持续进展。

    2.帕金森病(parkinson’s disease，pD)

    pD是一种中老年期常见的锥体外系疾病。主要临床表现为振颤、肌强直、运动减少及姿势步态异常等，主要病理改变为黑质致密部多巴

    胺能神经元的变性、死亡，导致输出至纹状体内的多巴胺含量的减少而

    引起相应的临床症状。pD病因和发病机制尚不完全清楚，可能是遗传

    因素和环境因素共同起作用。因此，众多学者提出了各种神经变性的机

    制，包括自由基及氧化应激、线粒体异常、兴奋性中毒、钙中毒、营养

    因子不足、炎症和细胞凋亡等来阐明其发病机制，其中对自由基及氧化

    应激学说，学者们有广泛的共识，其主要理论是多巴胺细胞氧化和抗氧化系统失衡导致帕金森病。

    与大脑的其余部分相比，黑质致密部暴露于高氧化应激和高活性氧

    (ROS)形成的状态中，这是因为：多巴胺的代谢过程就会产生许多细

    胞毒性分子，包括超氧化阴离子(O·-2)、多巴胺醌(SQ·)和羟自由

    基(Oh·)。在Fe2+存在时，多巴胺(DA)可自发降解或由单胺氧化酶

    (MAO)催化降解产生h2O2，即使h2O2对细胞没有直接损伤作用，在

    随后的Fenton 反应中生成的Oh·却有很强的细胞毒性。正常情况下，黑

    质部分的神经细胞有多个抗氧化系统，可以清除ROS，包括胞浆中

    Zn2+、Cu2+超氧化物岐化酶(SOD)、线粒体Cu2+、Mn2+超氧化物岐

    化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSh-pX)和谷胱

    甘肽(GSh)等。其中，脑内最重要的自由基清除系统是谷胱甘肽系

    统。有研究表明，pD患者的黑质中有30%～60%的GSh水平降低同时伴

    随Fe2+水平的升高，抗自由基和氧化损伤的能力明显不足，导致多巴胺

    能神经元的变性和凋亡。总之，帕金森病的众多发病机制研究中，自由

    基和氧化应激在引起神经变性机制、多巴胺神经元凋亡和死亡起重要意

    义。

    3.脑缺血-再灌注损伤

    脑缺血后短时间内ATp、磷酸肌酸(Cp)、葡萄糖、糖原等均减

    少，乳酸明显增加。缺血期cAMp含量增加，而cGMp含量减少。缺血-

    再灌注后脑内cAMp进一步增加，cGMp进一步下降，这提示缺血-再灌

    注时脂质过氧化反应增强。脑是一个富含磷脂的器官，再灌注后cAMp

    升高可导致磷脂酶激活，使膜磷脂降解，游离脂肪酸增多，最显著的是

    花生四烯酸及硬脂酸增多，自由基与游离脂肪酸作用使过氧化脂质生成

    增多。

    过量的自由基可使神经元的膜结构破坏，导致Ca2+进入细胞内，激

    活磷脂酶，后者可水解富含不饱和脂肪酸的神经细胞膜和细胞器膜中的

    磷脂，释放出大量的花生四烯酸。当自由基过多，超出了机体自身清除

    能力时，其中毒性极强的羟自由基将引发花生四烯酸过氧化，生成大量

    的脂质过氧化物，从而加剧了脑组织的损伤。

    脑缺血-再灌注早期，自由基攻击神经元内线粒体，线粒体呈现肿

    胀，引发线粒体通透性转换通道开放，使细胞色素C(cytochromec，cytC)从线粒体释放到胞浆中。cytC能激活caspase，诱导细胞凋亡。同

    时，线粒体通透性增加导致Ca2+大量流入，通过钙调节蛋白的作用，激

    活结构型一氧化氮合成酶(cNOS)，导致一氧化氮(NO)产生增多。

    在生理状态下，NO作为一种神经介质在中枢神经系统起着多种重要作

    用。当NO产生过多时，它又是一种自由基。它的损伤作用有两方面，其一是抑制呼吸链造成能量衰竭，引起神经元死亡；其二是损伤线粒体

    膜使促凋亡蛋白从线粒体漏出诱导神经元凋亡。再者，脑缺血后产生过

    多的NO和强氧化作用的氧化亚硝酸离子，可直接氧化脂质、DNA及蛋

    白质巯基，造成细胞致死性氧化损伤。脑缺血-再灌注后期，血液中内

    毒素、细胞因子刺激胶质细胞，又可激活诱导型一氧化氮合成酶

    (iNOS)合成更多的NO，从而加重脑缺血、脑水肿损害。

    脑缺血时，脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波。缺血一定时

    间后再灌注，慢波持续并加重。在夹闭双侧椎动脉和双侧颈总动脉的兔

    脑缺血-再灌注损伤模型中发现，颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢发

    生明显变化，即兴奋性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)随缺血-再灌注

    时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸(丙氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸和

    甘氨酸)在缺血-再灌注早期明显升高。缺血-再灌注损伤时间越长，兴

    奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变也越严重。

    脑最明显的组织学变化是脑水肿及脑细胞坏死，脑水肿的产生是膜

    脂质过氧化使膜的结构破坏和钠泵功能障碍的结果。

    四、自由基与消化系统

    1.肝缺血-再灌注损伤

    肝脏缺血-再灌注损伤是指肝脏组织缺血一段时间后恢复血流，其

    功能和结构难以恢复正常，其功能障碍和结构损伤反而加重的现象，常

    见于失血性休克、肝切除术和肝移植等情况时。

    其机制与自由基的损伤密切相关。氧自由基(OFR)可能是肝脏缺

    血-再灌注损伤组织中最早出现和最重要的成分之一。肝脏缺血-再灌注

    损伤时OFR增多的机制：(1)线粒体内单电子还原生成OFR增加。缺

    血-再灌注时提供了大量的氧，而线粒体呼吸链上的酶的活性还未能迅

    速增加，致使氧经单电子还原成OFR增多；细胞色素氧化酶系统因缺氧

    而受到抑制，使活性氧的产生增多。(2)组织缺氧时，血管内皮细胞

    内黄嘌呤氧化酶大量增加，导致OFR生成。(3)白细胞、Kupffer细胞

    等受缺氧刺激活化时出现呼吸爆发，通过细胞膜上的还原型NADph氧化

    酶释放大量的氧自由基。(4)缺血、缺氧时交感-肾上腺髓质系统释放

    大量儿茶酚胺，在单胺氧化酶的作用下自身氧化生成氧自由基。(5)

    缺氧导致细胞中抗氧化酶活性降低，氧自由基清除减少。

    OFR对肝细胞的损伤机制主要有:(1)OFR可协助Kupffer细胞杀伤

    入侵体内的微生物，其产生的氧自由基同时对蛋白质、核酸、骨胶原和

    多糖等正常生物物质均有氧化作用，并且Kupffer细胞激活后还可释放多

    种细胞因子和炎症介质，引起肝细胞炎症反应；(2)OFR对细胞双层磷脂结构中的重要脂类有氧化作用，生成多种脂质过氧化物，从而直接

    损伤肝细胞；(3)OFR能破坏细胞器结构膜，进而引起溶酶体、微粒

    体及线粒体破裂，最终导致细胞凋亡和坏死；(4)OFR可引起血小

    板、粒细胞在微血管中粘附和聚集，造成微循环障碍，导致肝脏功能、甚至结构损伤。

    2.急性胰腺炎(acute pancreatitis，Ap)

    Ap是临床凶险症之一，胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身

    消化的化学性炎症，尤其是重症急性胰腺炎(SAp )，来势凶猛，病情

    发展快，常并发胰外器官的损伤，其病死率可达20%～30%。近年来的

    研究证实氧自由基(OFR)与Ap的发生、发展有着密切关系。

    Ap发生时，胰腺内胰蛋白酶原、前弹性蛋白酶、激肽释放酶原、磷脂酶A2(phospholipase A2，pLA2)等被激活后，造成胰腺实质及临

    近组织的病变，细胞的损伤和坏死又促进消化酶释放，形成恶性循环，消化酶和坏死组织又可通过血液循环和淋巴管途径输送到全身，在此过

    程中产生大量OFR，引起多脏器损伤，成为Ap的多种并发症和致死原

    因。有学者证实Ap大鼠发病后10小时即有血浆和胰腺组织中的脂质过

    氧化物(LpO)明显增加，血浆LpO可破坏细胞膜的稳定性，细胞外基

    质胶原受损，使胰腺细胞溶酶体释放，还能激活多种胰酶，进一步造成

    胰腺组织损伤。

    Ap在发生发展过程中，OFR导致胰腺组织氧化损伤、过度的炎症反

    应产生大量的细胞因子、血管活性因子均可直接或间接导致微循环功能

    障碍，使组织缺血、缺氧，包括局部血流量减少，血流速度降低，白细

    胞附壁、毛细血管通透性增加以及功能性毛细血管密度降低。另外，由

    于炎症介质的作用，pMN 在各种组织、器官内聚集、活化，众多原因

    均可导致OFR以上述途径大量产生和释放，并进一步导致包括胰腺在内

    的各种组织器官的氧化损伤。(1)OFR可氧化细胞膜的不饱和脂肪

    酸，促使功能蛋白变性，导致膜的通透性增加，并进一步与膜上的花生

    四烯酸反应，生成脂自由基(LpO)、血栓素A2(TXA2)、白三烯

    B4(LTB4)等，形成级联反应，放大了氧化损伤。(2)OFR损伤细胞

    内蛋白质、酶发生氧化交联反应，活性丧失。(3)OFR尤其是羟自由

    基，可使DNA断裂，从而破坏核酸，诱发细胞凋亡或死亡。有研究发现

    OFR可通过活化核转录因子(NF-κB)引起血管内皮细胞、上皮细胞以

    及实质细胞粘附分子(ICAM-1)的表达及合成增加，ICAM-1可促进

    pMN聚集、粘附、激活，引起大量炎症介质、细胞因子，甚至导致胰腺

    及多个远隔器官的损伤和破坏(肝、肾、心、肺、脑等)，促使多器官

    功能衰竭(MSOF)的发生和发展。同时，由于机体内的大量白细胞的活化又进一步释放OFR，形成恶性循环。

    3.肠缺血-再灌注损伤

    肠缺血-再灌注损伤与自由基损伤密切相关。和大多数器官一样，其损伤最严重的时间不是缺血期，而是在微循环恢复灌注之后，肠黏膜

    细胞和血管内皮细胞产生大量氧自由基引起的损伤，其特征表现为广泛

    的上皮与绒毛分离、上皮坏死、固有层破损、出血及溃疡形成，最终可

    导致肠道屏障功能障碍、通透性增高，使大分子得以通过、细菌和毒素

    移位等，成为多种有害性生物活性物质的来源，进而引起单核巨噬细

    胞系统发生系列反应，释放大量炎症介质及细胞因子，导致全身性的反

    应，甚至引起多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction

    syndrome，MODS)与多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)等严

    重的情况。值得注意的是，肠缺血-再灌注损伤不仅可造成肠道组织的

    损伤和坏死，还可通过多种途径引起肠道局部组织和远隔器官(如脾、肺、心、肾等)的细胞出现凋亡性改变。

    五、自由基与肺

    正常情况下，肺部含有大量SOD、CAT、GSh-pX和谷胱甘肽转移

    酶等自由基清除剂，能及时清除多余的OFR。

    当机体遭到感染、创伤、中毒或休克等因素影响，肺部受累时(缺

    血、缺氧、缺血-再灌注、溺水、吸入有毒气体、SiO2、粉尘等)，如

    急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute

    respiratory distress syndrome，ARDS)，尘(矽)肺、慢性阻塞性肺病

    (chronic obstructive pulmonary disease，COpD)等，OFR 产生增多如

    不能及时清除，就会攻击肺泡细胞内DNA、蛋白质、脂质膜等，损伤和

    破坏肺部组织、细胞结构，致肺损伤，呼吸膜受损，肺泡毛细胞血管通

    透性增加，趋化多形核白细胞(pMN)、单核巨噬细胞的浸润和活

    化，导致“呼吸爆发”等产生更多的自由基，同时，肺泡细胞功能障碍，自由基清除功能降低。

    自由基与中性粒细胞(主要是pMN)、单核巨噬细胞之间的作用

    是导致肺损伤的中心环节：(1)自由基可减弱中性粒细胞的变形能

    力，致中性粒细胞在肺微循环的滞留、募集、活化；趋化因子、细胞因

    子等炎症介质进一步促进中性粒细胞的聚集；(2)自由基可激活NF-

    κB、激活蛋白-1(activator protei ......