ELISA非特异性显色原因分析
【摘要】 ELISA中非特异性显色的原因很多，如试剂盒特异性、检验标本中含酶标记物的干扰物，操作过程中的问题等。本文就这些原因作一简要分析,以便可以通过改进措施把非特异显色降至最低限度，从而提高检测的特异性，并得到更准确、可靠的实验结果。
【关键词】
ELISA;非特异性;显色
作者单位：454000河南省焦作市中心血站
酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年自问世以来，以其敏感性高、特异性强、操作简便、安全而广泛应用于临床诊断，开创了免疫学诊断的新纪元。但同其他免疫诊断方法一样酶免试剂在它的研究、生产及使用中常常会碰到非特异性问题，本文就在实验过程中产生的一些非特异性显色原因及如何采取措施进行消除作一简要分析。
1 试剂盒特异性因素
, 百拇医药
1.1 固相载体的选择 ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种，以微量滴定板最为常见。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各产品的质量差异很大。因此，在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证，评估。
1.2 包被物的纯度 在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中，试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。目前由于技术条件的限制，包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%，所以有些非特异性显色不可避免，只能尽可能提高纯度，提高特异性。目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原。
1.3 包被抗体的效价 具有高亲和力和高特异性的包被抗体，是决定试剂特异性的重要方面。
1.4 封闭 是ELISA中重要的一步，目的是封闭固相载体表面尚未被占据的空隙，减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。
, 百拇医药
2 检验标本中含有酶标记物的干扰物
2.1 内源性干扰物 类风湿因子(RF)、黄疸等，类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应，从而呈现非特异性显色。
2.2 外源性干扰物，常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。溶血标本，红细胞溶解破裂，释放Hb，而Hb中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，如在冰箱中保存过久，其中的IgG可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。因此，血液标本在采集处理时应小心，在冰箱中保存不易过久。 标本凝集不全时，血清中会残留部分纤维蛋白原，也易造成假阳性。
3 操作过程中的问题造成假阳性
, http://www.100md.com
3.1 加样
对于间接ELISA标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的绝对误差，会导致较大的相对误差，使阴性(或弱阳性)标本呈阳性(或阴性)。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。
3.2 洗涤
在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是自动化设备操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
3.3 温育
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每种试剂都有其最佳反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。
3.4 酶标仪判读
作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，最好使用双波长，一个检测波长，一个参考波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的干扰。此外，在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。
综上所述，由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清(血清盘)。但由于受方法学及技术条件的限制，在实验中有时不可避免的会出现一定的非特异性显色，但我们可以通过注意以上几个方面把非特异性显色降至最低限度，从而提高检测的特异性，得到更准确、可靠的实验结果。, http://www.100md.com(孔莉娜 李北 李燕红)
【关键词】
ELISA;非特异性;显色
作者单位：454000河南省焦作市中心血站
酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年自问世以来，以其敏感性高、特异性强、操作简便、安全而广泛应用于临床诊断，开创了免疫学诊断的新纪元。但同其他免疫诊断方法一样酶免试剂在它的研究、生产及使用中常常会碰到非特异性问题，本文就在实验过程中产生的一些非特异性显色原因及如何采取措施进行消除作一简要分析。
1 试剂盒特异性因素
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1.1 固相载体的选择 ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种，以微量滴定板最为常见。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各产品的质量差异很大。因此，在选择试剂盒同时要对其使用的微孔板型号进行认证，评估。
1.2 包被物的纯度 在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中，试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。目前由于技术条件的限制，包被用抗原或抗体的纯度不可能达到100%，所以有些非特异性显色不可避免，只能尽可能提高纯度，提高特异性。目前使用的包被抗原一般为合成多肽抗原。
1.3 包被抗体的效价 具有高亲和力和高特异性的包被抗体，是决定试剂特异性的重要方面。
1.4 封闭 是ELISA中重要的一步，目的是封闭固相载体表面尚未被占据的空隙，减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。
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2 检验标本中含有酶标记物的干扰物
2.1 内源性干扰物 类风湿因子(RF)、黄疸等，类风湿因子是可作用于多种动物以及人IgGFc段的自身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应，从而呈现非特异性显色。
2.2 外源性干扰物，常常因样品采集、贮存、处理不当造成如样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。溶血标本，红细胞溶解破裂，释放Hb，而Hb中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，如在冰箱中保存过久，其中的IgG可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。因此，血液标本在采集处理时应小心，在冰箱中保存不易过久。 标本凝集不全时，血清中会残留部分纤维蛋白原，也易造成假阳性。
3 操作过程中的问题造成假阳性
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3.1 加样
对于间接ELISA标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的绝对误差，会导致较大的相对误差，使阴性(或弱阳性)标本呈阳性(或阴性)。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。
3.2 洗涤
在ELISA中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是自动化设备操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
3.3 温育
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每种试剂都有其最佳反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。
3.4 酶标仪判读
作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，最好使用双波长，一个检测波长，一个参考波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的干扰。此外，在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。
综上所述，由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前国际上以及我国有了部分标准血清或参比血清(血清盘)。但由于受方法学及技术条件的限制，在实验中有时不可避免的会出现一定的非特异性显色，但我们可以通过注意以上几个方面把非特异性显色降至最低限度，从而提高检测的特异性，得到更准确、可靠的实验结果。, http://www.100md.com(孔莉娜 李北 李燕红)