丹参酮ⅡA对鼠肝星状细胞活化Ca2+效应的抑制作用(1)
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【摘要】 目的 研究丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA)药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙([Ca2+]i)增高的作用。方法 健康SD大鼠32只,按随机数字表随机分为4组:肝纤维化模型丹参酮ⅡA组(8只) 给予用精制橄榄油配制的 40%CCl4 溶液,9 周后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;肝纤维化模型对照组(8只)给予用精制橄榄油配制的40%CCl4 溶液，9周后灌服生理盐水15 d;正常大鼠丹参酮ⅡA组(8只)仅给予等量精制橄榄油9周,然后腹腔注射丹参酮ⅡA(15 mg/kg)15 d;正常对照组(8只)仅给予等量精制橄榄油，9周后灌服生理盐水15 d。结束后,经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法,用上述 10%血清培养 HSCs24 h并负载好 Fluo23PAM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测 HSCs[Ca2+]i。结果 ①经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组的血清预处理的 HSCs,其[Ca2+]i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P<0.05);且二者与正常对照组相比也均差异有统计学意义(P<0.05)。②经正常大鼠丹参酮ⅡA组及肝纤维化模型丹参酮ⅡA组血清预处理 HSCs后加入 AngⅡ,HSCs[Ca2+]i荧光强度变化百分数显著低于肝纤维化模型对照组(P<0.01)。结论 丹参酮ⅡA能抑制肝星状细胞活化[Ca2+]i的升高,可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。
大量实验研究表明丹参等活血化瘀药物为主的方法治疗肝纤维化(HF)均取得了较好疗效。肝星状细胞(HSC)是肝内细胞外基质的主要来源，HSCs激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFLC)，是肝纤维化发生、发展的核心环节。各种致纤维化因素均把HSCs作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展。丹参酮ⅡA为丹参的一种主要组分，有研究表明丹参酮ⅡA对活化的肝星状细胞有明显抑制作用，但其作用机制不详。目前，丹参酮ⅡA临床已经用于心脏、肾脏等纤维化疾病的治疗，且其疗效确切，加之目前丹参酮ⅡA抗肝纤维化的研究成果，提示丹参酮ⅡA在将来的治疗肝纤维化的新的临床应用方面具有良好前景。本实验将在细胞水平和分子水平深入探讨丹参酮ⅡA抗肝纤维化的作用机制，进一步阐明其对肝纤维化时肝星状细胞活化的钙离子信号转导通路的影响和作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性清洁级 SD大鼠32只,体质量180～250 g,由河北医科大学实验动物中心提供。动物进行完全随机设计,按随机数字表随机分组如下:A 组为正常对照组(n =8);B 组为正常大鼠丹参酮ⅡA组(n =8);C组为肝纤维化模型对照组(n =8);D 组为肝纤维化模型丹参酮ⅡA组(n =8)。
1.2 细胞株
肝星状细胞株 CFSC由美国 Greenwel 教授建株并惠赠,其表型为活化的 HSCs,从四氯化碳(CCl4)诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性,冷冻保存于液氮中。
1.3 主要仪器
激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。
1.4 试剂
AngⅡ购自美国 Sigma公司, 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液购自上海市第一生化药业有限公司,RPMI -1640购自美国 Gibco 公司,FLUO-3,AM Ester 及 PluronicF-127均购自美国 Biotium公司,其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.5 液体配制
台氏液(mmol/L) :NaCl 135, KCl 4.0, CaCl2 1.0, MgCl2 1.0, HEPES 10, glucose10, 用NaOH将pH值调至7.4。
1.6 药物血清的制备及细胞培养
正常大鼠及CCl4造模后肝纤维化大鼠进行药物腹腔注射,再分别制备两种不同药物血清进行体外细胞培养。
1.6.1 动物实验
1.6.1.1 造模 C、 D组:精制橄榄油配制 40%[ml/L]CCl4溶液:每周2次,首次4 ml/kg,以后2 ml/kg,皮下注射,连续9周。A、 B组:精制橄榄油皮下注射,同 CCl4 所用方法相同。
1.6.1.2 药物血清制备 造模成功后,药物组(B、 D组)以每天15 mg/kg剂量腹腔注射;对照组(A、 C组)灌以等体积生理盐水。连续给药15 d后,晚间禁食 12 h,次日按常规量再腹腔注射 1 次,分别于2 h后下腔静脉取血、离心并分离血清,其中有溶血者弃之不用。同组血清合并混匀,56℃，30 min水浴灭活,-70℃保存。
1.6.2 细胞培养 ①将冷冻保存于液氮中的HSCs复苏后接种于含10%胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、4 mmol/L L-谷氨酰胺及1 mol/L HEPES的10%RPMI-1640培养液(pH7.4)中,37℃、5%CO2条件下培养。当细胞呈单层致密状时,用0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3传代,24 h换液,72 h再次传代。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行,将2 cm×2 cm盖玻片预先放置在6孔培养板,细胞消化后以1.0×107/L的密度接种2 ml制备爬片,培养箱中孵育至细胞80%融合时,弃培养液,换不含胎牛血清的细胞培养液继续培养24 h,使细胞基本同步化于G0期后进行药物血清预处理实验。②药物血清预处理:将上述爬片细胞分为4组,每孔加入10%RPMI-1640培养液900 μl,然后各实验孔采用盲法分别给予已制备好的药物血清或对照组血清100 μl,终浓度为10%,每组设3个复孔。继续培养24 h后进行实验。
1.7 钙荧光探针的负载
钙荧光探针Fluo-3/AM用纯DMSO配成1 mmol/L的储备液,-20℃避光保存备用。促溶剂F-127溶于DMSO(F-127∶DMSO质量比为1∶5)室温保存备用。实验前取1 μlFluo-3/AM储备液溶于1 ml台氏液,再加入1 μlF-127,混匀后向培养板中加500 μl Fluo-3/AM,终浓度为1 μmol/L ......
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