FAT对K562/A02细胞内GSH含量的影响(2)
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参见附件。
将K562/A02细胞置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，诱导药物阿霉素的浓度从低(0.6 μg/ml)到高(可达到2 μg/ml)，最后在培养体系中加入终浓度为1 μg/ml的阿霉素(ADM)长期传代培养，以维持耐药性，培养条件同K562细胞，实验前无药培养2周。
1.2.2 DTNB法测定FAT对K562/A02细胞内GSH表达的影响
1.2.2.1 标准曲线的制作 取700 μl NADPH液加100 μL DTNB液中；对照管加200 μl去离子水；样品管加50、100、150 μmol/L的GSH标准液200 μl，加GSSG还原酶2 μl，混匀后，用紫外分光光度计测定吸光度，波长定于412 nm，如图1所示。
1.2.2.2 标本处理 取细胞形态良好、对数生长期的K562细胞和K562/A02细胞分别离心(600 rpm/min；5 min)，弃上清，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基稀释细胞至5.6×105个/ml，再将细胞悬液接种于24孔培养板，900 μl(5×105个细胞)/孔，实验分组：①FAT 0.02 mg/ml；②FAT 0.04 mg/ml；③FAT 0.08 mg/ml；④VRP 10 μmol/L；按实验分组分别加入相应浓度的药物工作液100 μl/孔，混匀后在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，同时取对数生长期的K562/A02细胞和K562细胞，不加逆转剂，作为对照，48 h后，收集细胞到离心管中，离心(1 500 rpm/min；2 min)，弃上清液，用冷PBS洗3次，再加PBS调整细胞数为1×106/ml，用以测定 K562细胞和K562/A02细胞内GSH含量。取上述各组细胞数为1×106/ml的细胞悬液，经细胞破碎仪破碎细胞，1 000 g离心5 min，取上清液200 μl加100 μl 10%磺基水杨酸混匀，1 000 g离心5 min，去蛋白，用上清液200 μl去测OD值。方法同标准曲线的制作[12]。
1.3 统计学方法
实验数据用x±s表示，并用组间t检验分析差异的显著性。
2 结果
DTNB法检测结果(表1)显示：K562/A02细胞内GSH含量(231.54 μmol/106细胞)远远高于K562细胞内GSH含量(58.03 μmol/106细胞)，为K562细胞的3.99倍；FAT可减少K562/A02细胞内GSH含量，VRP(10 μmol/L)、FAT(0.01、0.02、0.04、0.08 mg/ml)作用48 h后，K562/A02细胞内GSH含量从231.54 μmol/106细胞分别减少到96.95 μmol/106细胞、212.89 μmol/106细胞、161.00 μmol/106细胞、122.35 μmol/106细胞，但仍高于K562细胞内GSH含量，说明FAT可减少K562/A02细胞内GSH的表达，并且与剂量相关，但是效果没有VRP显著，趋势见图2。
3 讨论
肿瘤细胞GSH含量增高是导致MDR的原因之一，降低GSH水平可以提高肿瘤细胞对药物的敏感性，增强化疗疗效，逆转MDR。本试验显示了FAT作为有效多药耐药逆转剂的一些药理学特征：K562/A02细胞内GSH含量远远高于K562细胞内GSH含量，经无毒剂量的FAT作用后，K562/A02细胞内GSH含量减少，推测FAT可能通过减少GSH的表达或与GSH结合来降低细胞内GSH含量，并且与剂量相关。FAT对GSH酶系统如GST、GSH-Px、γ-GCS等的影响有待进一步研究。
[参考文献]
[1] Oza AM.Clinical development of P-glycoprotein modulators in oncology[J].Novartis Found Symp，2002，243(1)：103-115.
[2] Peer D，Margalit R.Fluoxetine and reversal of multidrug resistance[J].Cancer Lett，2006，237(2)：180-187.
[3] 戴舒柳，罗曼，李化，等.柠檬醛胁迫下K562细胞生长增殖抑制和凋亡诱导研究[J].中国中药杂志，2011，36(10)：1370-1373.
[4] 刘明华 ......
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